Procesamiento de sitios abásicos en el DNA

Artículo publicado en noviembre de 2017

DOI: http://dx.doi.org/10.18567/sebbmdiv_ANC.2017.11.1

Miguel de Vega

Grupo de investigación "Reparación del DNA bacteriano" en el Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM)

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El DNA está continuamente expuesto a agentes genotóxicos causantes de múltiples lesiones en esta molécula. De entre ellas, una de las más frecuentes y deletéreas es la generación de sitios abásicos que puede conducir a la generación de roturas de doble cadena del DNA, así como al bloqueo de procesos esenciales como la replicación y la transcripción.

 

De entre los múltiples tipos de lesiones que pueden surgir en el DNA, una de las más frecuentes es la generación de sitios abásicos (AP), que en el caso de células de mamíferos aparecen con una frecuencia de entre 10.000 y 50.000 por célula y día. Los sitios AP pueden originarse por la depurinización espontánea de los nucleótidos, o tras la acción de glicosilasas que hidrolizan el enlace glicosídico para eliminar tanto bases nitrogenadas dañadas como el uracilo resultante de la desaminación de las citosinas. La proximidad de sitios AP en las dos cadenas del DNA pueden dar lugar a roturas de doble cadena (DSBs, del inglés Double Strand Breaks) que son las lesiones más peligrosas que puede sufrir el DNA ya que pueden provocar reordenaciones cromosómicas o la muerte celular (Hoeijmakers, 2001), siendo pues su reparación crucial para el mantenimiento de la integridad del genoma.

Las DSBs generadas ya bien sea por proximidad de sitios abásicos, como por otros agentes genotóxicos, como la radiación ionizante, pueden ser reparadas básicamente por dos mecanismos: la recombinación homóloga (HR, del inglés Homologous Recombination), y la unión de extremos no homólogos (NHEJ, del inglés Non homologous End Joining). En la HR la información de una copia intacta del DNA "roto" se emplea como molde para la síntesis de DNA en el sitio de la rotura, de manera que la lesión se repara de manera fiel, de ahí que sea la ruta de reparación principal en bacterias en proliferación, así como durante las fases S y G2 de células eucariotas (Krejci et al., 2003). Por el contrario, debido a que en la NHEJ la unión de los extremos es directa, no se requiere la presencia de una copia adicional de DNA que actúe como molde, siendo una ruta activa a lo largo del ciclo celular eucariota, así como en muchas bacterias que pasan parte de su ciclo vital en estado estacionario en el que solo hay una copia del DNA. Durante la NHEJ, los extremos de la rotura son usualmente procesados por actividades nucleolíticas y/o de polimerización antes del paso final de ligación. Esto hace que el resultado final de la reparación sea una molécula de DNA en la que se han insertado/delecionado uno o varios nucleótidos en el sitio donde se produjo la rotura, por lo que esta ruta de reparación es frecuentemente infiel o mutagénica (Pitcher et al., 2007).

En nuestro grupo estamos interesados en estudiar las características bioquímicas de los componentes del sistema NHEJ bacteriano. Se trata de un sistema mínimo constituido por dos proteínas: un homodímero de la proteína Ku y una proteína multicatalítica denominada Ligasa D (LigD). El homodímero Ku tiene forma de anillo y reconoce la rotura, enhebrando los extremos a través de su canal central (ver Figura 1A). Posteriormente recluta a LigD, que en muchos casos contiene una actividad nucleasa, polimerasa y ligasa, que se encargan del procesamiento de los extremos, el relleno de los huecos (gaps) que surgen cuando se produce la sinapsis entre los dos extremos de la rotura, y de la ligación final de las cadenas, respectivamente (Pitcher et al., 2007). Nuestros últimos resultados han demostrado que si se encuentran sitios AP próximos a extremos 5´ protuberantes de la DSBs, son reconocidos y procesados por Ku gracias a una nueva actividad catalítica denominada AP-liasa que rompe el enlace fosfodiéster 3´ del sitio AP, dando lugar a una pequeña deleción (de Ory et al., 2014). Posteriormente, la LigD es reclutada a la rotura, lleva a cabo el relleno del gap por su actividad polimerasa y finalmente liga el grupo 3´-OH de uno de los extremos de la rotura con el 5´-P, generado tras la actividad AP-liasa de Ku, del otro extremo (ver Figura 1A).

Por otra parte, la presencia de sitios AP en solo una de las cadenas de DNA también puede tener consecuencias mutagénicas y citotóxicas ya que son sitios "no informativos" que las DNA polimerasas replicativas y las RNA polimerasas no son capaces de utilizar como molde durante la incorporación de nucleótidos, pudiendo dar lugar a un bloqueo de procesos esenciales como la replicación y la transcripción. En este caso, la reparación de los sitios AP es llevada a cabo mediante la ruta de reparación por escisión de bases (BER), la más frecuentemente utilizada in vivo y en la que los enzimas que participan están conservados en procariotas y eucariotas (Almeida y Sobol, 2007). El sitio AP es reconocido por una AP-endonucleasa que hidroliza el enlace fosfodiéster 5´ del sitio AP, generando un extremo 5´-deoxiribosa fosfato (dRP) que ha de ser eliminado por una 5´-dRP liasa para generar un extremo 5´-P. El pequeño gap resultante es posteriormente rellenado por una DNA polimerasa que restaura el nucleótido original. Finalmente, los extremos 3´ y 5´ son sellados por una DNA ligasa. Hasta ahora, estas actividades parecían residir en proteínas independientes. Sin embargo, recientemente hemos mostrado cómo la proteína LigD, además de las actividades polimerasa y ligasa ya comentadas anteriormente presenta una actividad 5´-dRP liasa, encargada de sanear los extremos 5´dRP que surgen durante la reparación de sitios abásicos tras la actuación de la AP endonucleasa (de Ory et al., 2016). Hemos demostrado cómo la LigD es capaz por sí sola de reconocer el nick generado por una AP endonucleasa, rellenar el hueco resultante restaurando el nucleótido original, eliminar el extremo 5´-dRP y finalmente sellar las dos cadenas de DNA (ver esquema en Figura 1B). Esta actividad parece ser general de las proteínas LigD ya que tanto la LigD de Bacillus subtilis como la de Pseudomonas aeruginosa la poseen. Además, hemos demostrado in vivo la importancia de dicha actividad, ya que esporas de B. subtilis carentes de LigD y sometidas a daño oxidativo (que es fundamentalmente reparado por la vía BER) presentan una caída drástica de la viabilidad celular.

Estos resultados expanden la intervención de esta proteína en diferentes vías de reparación, haciendo que sea una potencial diana terapéutica para la generación de inhibidores de dicha proteína que podrían conducir a la muerte bacteriana.

 

 

 

Figure 1

Figura. (A) Reparación de roturas del DNA por el sistema NHEJ bacteriano. (B) Esquema de la reparación de sitios AP por la LigD bacteriana.

 

Referencias:

1. Almeida, K.H., and Sobol, R.W. (2007). DNA repair 6, 695-711.
2. de Ory, A., Nagler, K., Carrasco, B., Raguse, M., Zafra, O., Moeller, R., and de Vega, M. (2016). Nucleic Acids Res.44, 1833-1844.
3. de Ory, A., Zafra, O., and de Vega, M. (2014). Nucleic Acids Res.42, 13082-13095.
4. Hoeijmakers, J.H. (2001). Nature 411, 366-374.
5. Krejci, L., Chen, L., Van Komen, S., Sung, P., and Tomkinson, A. (2003). Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 74, 159-201.
6. Pitcher, R.S., Brissett, N.C., and Doherty, A.J. (2007). Annu. Rev. Microbiol.61, 259-282.

 

 

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Entrevista

Miguel de Vega
Grupo de investigación "Reparación del DNA bacteriano" en el Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM)

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P.- ¿Cuándo surgió su vocación científica?

R.- Realmente no existe un momento determinado en el que surgiera esa vocación, sino que se fue desarrollando poco a poco. Sí que es cierto que desde pequeño siempre sentí un interés muy grande en comprender los procesos naturales, siempre leyendo libros de naturaleza y mirando por el microscopio cualquier cosa que cayera en mis manos, lo que me llevó a estudiar Biología. Según cursaba la carrera en la Universidad Autónoma de Madrid tuve la suerte de tener muchos profesores que te transmitían su pasión por la investigación, despertando en mí un gran interés por la especialidad de Bioquímica y Biología Molecular y que motivó que a finales de tercero de carrera ingresara en el laboratorio de la Dra. Margarita Salas en el Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, en un momento en el que era un verdadero "hervidero científico". Fue entonces cuando me di finalmente cuenta de a qué quería dedicarme.

P.- ¿Podría resumirnos brevemente su trayectoria profesional?

R.- Tras concluir mis estudios de biología en la UAM, comencé la Tesis doctoral en el laboratorio de Margarita Salas en el Centro de Biología Molecular Severo Ochoa y bajo la dirección del Dr. Luis Blanco. Mi trabajo de Tesis se orientó al estudio de las DNA polimerasas replicativas y al mapeo de los residuos responsables de las diferentes actividades, utilizando como modelo la DNA polimerasa del bacteriófago phi29. Mis estudios permitieron proponer la conservación evolutiva del centro activo exonucleasa 3´-5´, así como determinar el papel crítico que en esta actividad tenían los ligandos de DNA.
En mi etapa postdoctoral determinamos cuales son las bases estructurales de la especificidad entre la DNA polimerasa replicativa y su molécula iniciadora (TP, del inglés Terminal Protein). Describimos que el dominio C-terminal de la TP es el responsable en conferir especificidad respecto al nucleótido que es utilizado como molde en la iniciación de la replicación. Por otra parte vimos que la inserción específica TPR2 de las DNA polimerasas primadas con TP es responsable de las dos características distintivas de la DNA polimerasa de phi29, procesividad y capacidad de acoplar la polimerización al desplazamiento de banda, que hacen que sea el enzima de elección en las tecnologías de amplificación isotérmica de DNA. En el año 2006 obtuve la plaza de Titulado Superior Especializado del CSIC. Gracias al profundo conocimiento de la bioquímica y estructura de la DNA polimerasa de phi29 que habíamos ido adquiriendo a lo largo de los años construí variantes de la polimerasa mediante la fusión de ésta a motivos HhH mejorando así la capacidad de amplificación de cantidades limitantes de DNA tanto circulares como genómicos lineales. Esta invención se patentó y actualmente está siendo explotada por la biotech hispano-germana Sygnis SL.
En el año 2009 obtuve la plaza de Científico Titular del CSIC. Además de continuar con los estudios de los sistemas de replicación comencé a investigar la enzimología de la reparación del DNA bacteriano, utilizando como modelo la DNA polimerasa X de reparación de Bacillus subtilis (PolXBs). Por primera vez identificamos una actividad exo 3´-5´ en el dominio PHP, específicamente presente en este tipo de polimerasas, especializada en la resección de extremos 3´ dañados. Además, identificamos la presencia en PolXBs de una actividad AP-endonucleasa genéticamente ligada a la exonucleasa y que en coordinación con la actividad de polimerización capacita a la enzima a reconocer, incidir y finalmente reparar sitios abásicos en el DNA. Mediante estudios funcionales de mutantes puntuales determinamos cómo se coordinan las diferentes actividades del enzima.Desde el año 2013 soy jefe del grupo "Reparación del DNA bacteriano" en el CBMSO siendo nuestro objetivo profundizar en el análisis de las DNA polimerasas X, así como otros factores de reparación de roturas del DNA de banda doble (DSBs), como son las proteínas Ku y LigD bacterianas. Nuestros estudios más recientes han demostrado la presencia de una actividad 5´-dRP/AP liasa hasta ahora desconocida que permiten al factor Ku y la LigD bacterianas procesar sitios abásicos en roturas de DNA de banda doble.

P.- ¿Cuál consideraría que ha sido el principal avance científico del siglo XX?

R.- Complicado quedarse con uno solo. Yo creo que en el campo de la Biología Molecular uno fue la determinación de la estructura en doble hélice del DNA por Watson, Crick y Franklin en la que la disposición antiparalela y complementaria de las dos cadenas respondía casi inmediatamente a la pregunta de cómo se podía transmitir de manera fiel la información genética de una generación a la siguiente. Por otra parte, la demostración por Chang, Boyer, Heiling y Cohen de que los genes podían clonarse y aislarse mediante el empleo de enzimas de restricción y unirlos mediante DNA ligasas a moléculas autoreplicativas como los plásmidos. Esto es algo que hoy hacemos de manera rutinaria en todos los laboratorios pero que supuso el surgimiento de la Ingeniería Genética y permitió dar pasos de gigante en el estudio de la estructura y función del gen y en el desarrollo de la biotecnología. Esta tecnología del DNA recombinante experimentó décadas más tarde un avance espectacular por la implementación de la Reacción en Cadena de la DNA polimerasa (PCR) inventada por Mullis y gracias a la cual se podía amplificar in vitro cualquier secuencia de DNA para posteriormente manipularla.

P.- ¿Cuál es el avance científico que más le ha impresionado?

R.- Creo que como a gran parte de la sociedad científica, el avance científico que nos está impresionando, y que está ocurriendo en el momento actual es el desarrollo de la tecnología CRISPR/Cas, mediante la cual se puede alterar o corregir una determinada región del DNA, de manera extraordinariamente precisa y rápida, con unas aplicaciones casi inimaginables tanto en ciencia básica, medicina y biotecnología.

P.- ¿Cuáles son desde su punto de vista las características que definen a un buen investigador?

R.- Creo que un investigador ha de ser en primer lugar curioso, estar continuamente haciéndose preguntas y tener el ánimo de resolverlas. Tener una gran perseverancia, la ciencia es una carrera de fondo en la que los resultados pueden tardar mucho tiempo en llegar, y ser inasequible al desaliento. Tiene que ser autocrítico, analítico, riguroso y honesto. Estar en un proceso de formación constante y a su vez formar a otros futuros investigadores. Tiene que ser capaz de divulgar los resultados de sus investigaciones, no solo a la comunidad científica sino lo que es más difícil, al resto de la sociedad. Sólo así podremos algún día conseguir que se entienda el por qué es necesario invertir en ciencia para el desarrollo de un país.

P.- ¿Cuál es su opinión sobre cómo está articulada la carrera científica en España?

R.- España es la gran centrifugadora de investigadores de Europa. Como en el resto de países, en España una vez realizada la Tesis doctoral, la mayor parte de los investigadores se van al extranjero para seguir formándose, haciendo una o varias estancias postdoctorales. El mayor problema de los investigadores españoles surge cuando quieren regresar. Tal y como está articulada la ciencia en España, el sistema es fundamentalmente funcionarial, tanto en los Organismos Públicos de Investigación como en la Universidades. Teniendo en cuenta el descenso dramático del número de plazas convocadas en los últimos años, y que la inversión estatal en I+D en España es del 1.5 % del PIB, cinco décimas por debajo de la media europea, con un descenso paulatino de las subvenciones de las que dependemos la mayoría de los laboratorios, solo una pequeña parte de los investigadores podrán desarrollar de manera estable una carrera científica en España. El resto está condenado a irse de nuevo al extranjero o finalmente dedicarse a otra profesión, después de haber invertido quince o veinte años desde que comenzaron la Tesis. Los postdocs españoles están muy bien considerados en el resto del mundo por su alta cualificación. No tiene sentido que al final sean otros los que se beneficien de la formación de nuestros científicos y por lo tanto del dinero que costó dicha formación. Esta situación es el reflejo del poco interés que los gobiernos, de uno u otro signo tienen en la ciencia, de hecho, ni siquiera tenemos ya un Ministerio propio, sino que dependemos del de Economía y Competitividad.

 

Perfil biográfico

Miguel de Vega
Grupo de investigación "Reparación del DNA bacteriano" en el Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM)

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Miguel de Vega (Madrid, 1971) es Doctor en Ciencias Biológicas por la Universidad Autónoma de Madrid (1998, premio extraordinario de la UAM y premio Juan Abelló Pascual I de la Real Academia de Doctores). Desde el año 2009 es Científico Titular del CSIC y dirige el grupo de investigación "Reparación del DNA bacteriano" en el Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM). Su línea de investigación se centra en el estudio bioquímico de la enzimología de la reparación y replicación del DNA. Ha dirigido siete Tesis Doctorales, es coautor de cuarenta y siete publicaciones internacionales, así como de tres patentes, una de las cuales recibió el IX Premio Madri+d a la mejor patente de la Comunidad de Madrid (2013).

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