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Revista: Vida artificial


Hacia una biología alternativa

Nuestra capacidad de control, modificación y reacomodación del material genético desdibuja los límites de lo que es posible hacer mediante la manipulación genética. Esta situación plantea un enorme potencial no excluyente de riesgos para la bioseguridad, ya que la transferencia horizontal y la universalidad de nuestro código genético supone serias limitaciones a la contención de un material genético modificado. Por ello cada vez es mayor el interés en desarrollar una genética alternativa donde el dogma de la biología molecular corra ortólogo al compartido por toda la biota.

  • Carlos Rodríguez Caso

  • ICREA-Complex Systems Lab Departamento de Ciencias Experimentales y de la Salud Universitat Pompeu Fabra, Barcelona

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usto antes de que Júpiter se convierta en una supernova, Bowman regresa a la Discoverypara darle una última orden a HAL: la transmisión de un mensaje a la Tierra. El mensaje dice: «Todos estos mundos son vuestros, excepto Europa. Absteneos de aterrizar allí». Con este fragmento de 2010 Odisea dos de Arthur C. Clark1 termina una interesante reseña de J. G. Joyce en Science2 acerca de la generación de una biología alternativa a partir de la creación de moléculas contenedoras de información desde una química distinta, ortóloga, a la de nuestra genética. En la cita a esta obra, Joyce hace referencia a los «mundos» que desde la biología sintética se pueden crear a través de la manipulación de la información hereditaria y como nota final apunta a los riesgos que este camino puede conllevar el trabajar directamente con el DNA.

De hecho, podemos decir que por primera vez en la historia de la biota una especie, el Homo sapiens, accede a la capacidad de trasformar de forma racional, es decir diseñada, lo que puede llegar a ser un organismo y su linaje. Esto supone unos cambios en las reglas de la evolución que han permanecido constantes a lo largo de la historia de la biota desde LUCA (del inglés, ‘último ancestro común’). Si bien la introducción de genes a través de la transferencia horizontal no es algo nuevo en la evolución, sí lo es el camino que se ha iniciado.

Desde el descubrimiento de los enzimas de restricción, nuestra capacidad de manipular el DNA no ha dejado de incrementar, desde la incorporación y deleción de genes hasta el diseño de circuitos genéticos, que permiten entender la célula como una maquina de computación al servicio del hombre.3 En la explotación del DNA, los avances técnicos son asombrosos. Hablamos del diseño y ensamblajes de genomas ex vivo como el realizado en el del grupo de Craig Venter en micoplasma, la capacidad de edición a la carta del DNA mediante mecanismos, las CRISPR o la cada vez más accesible síntesis de genes por parte de empresas biotecnológicas.

Si hubo en la etapa prebiótica algún otro sistema de gestión de la información molecular, no está claro, pero lo que parece seguro es que el único que ha sobrevivido es el que conocemos. Hasta el momento, la universalidad de la química del ser vivo basada en los cinco ácidos nucleicos canónicos A, T, C, G, y U y los 20 aminoácidos proteíno-genéticos son –salvo ligeras excepciones– respetados a lo largo de toda la biota. Por tanto trabajamos con un sistema que gracias a su universalidad permite intercambiar y reutilizar piezas pero quizás, llegados a este punto, ¿puede resultar demasiado promiscuo?

Tal potencial puede implicar riesgos para nosotros, o para la biota en general, haciendo que el tema de la bioseguridad dentro del ámbito de la biología sintética sea un aspecto cada vez más considerado. Pero ¿cómo construir un circuito genético cuyos efectos estén controlados y además tengan una capacidad de autoperpetuarse en los organismos? ¿Se puede generar una alternativa al DNA? ¿Cómo conseguir un flujo de información como el que resume el dogma central de la biología molecular que además no interfiera con su correlato natural?

Las respuestas parecen venir de la xenobiología, una disciplina a caballo entre la química, la biología y la astrobiología cuyo objeto es estudiar las posibles formas alternativas de vida en base a los condicionantes físicos-químicos que se hubieran dado en nuestro pasado prebiótico y/o en otros planetas. De la exploración de formas análogas al DNA y moléculas autocatalíticas ha surgido todo un conocimiento de una serie de compuestos químicos compatibles con la formación de moléculas contenedoras o procesadoras de la información. La aplicación de este conocimiento a la generación de una genética alternativa, en una química ortóloga a la de la vida, ahora se plantea desde la biología sintética como una solución para la construcción de sistemas genéticos bioseguros. Sin embargo, el reto de crear un sistema completamente ortólogo al de la vida es enorme y, como veremos, los avances que se han realizado son aún modestos, basados en variaciones sobre el sistema natural, sin que todavía una química verdaderamente independiente esté a la altura de permitir crear un sistema autónomo vivo. La figura 1 sintetiza las aproximaciones citadas en este trabajo.

 

Figura 1. El dogma de la biología molecular junto con algunas de las aproximaciones realizadas en la obtención de mecanismos ortólogos para la creación de sistemas genéticos seguros.

 

Uno de los primeros avances en este sentido ha sido el desarrollo de XNA4. El XNA (haciendo referencia a ácidos xenonucleicos) es el término que se utiliza para referirse a aquellos ácidos nucleicos que presentan un análogo a la ribosa o desoxirribosa del DNA o RNA. En este caso, las bases nitrogenadas son las mismas, pero la diferencia en la cadena carbonatada implica que las polimerasas naturales no puedan actuar sobre ellas. Según muestra la figura 2A, hay ejemplos diversos: los basados en azúcares de cinco carbonos como el ANA con arabinosa o FANA con 2’-fluoroarabinos; azúcares de cuatro carbonos como TNA basados en triosa, LNA basado en una ribosa «cerrada» o los de anillos seis carbonos como el CeNA de ciclohexano o el HNA de anhidrohexitol.1,3

Curiosamente el desarrollo de estos compuestos no viene precisamente de la necesidad de construir constructos seguros, sino de aplicaciones ajenas a este tema. Desde la xenobiología muchas de estas moléculas son el fruto de explorar los posibles polímeros primordiales de la vida sobre la Tierra. Por otra parte, algunos de estos XNA fueron desarrollados con fines biotecnológicos como moléculas sintéticas en ensayos de antisentidos que pudieran resistir a los mecanismos de degradación moleculares.

Su aplicación desde la biología sintética es distinta. Se trata de desarrollar moléculas contenedoras de información ortólogas al DNA y RNA. Sin embargo, la polimerización requiere enzimas que no existen en la naturaleza y, por tanto, deben ser ingenierizados. La generación de XNA polimerasas constituye un gran reto dentro de esta área y todavía son pequeños los pasos que se han dado. En el artículo de Pinheiro et al.5 se propone un sistema transcripción del XNA que todavía requiere la presencia de un molde de DNA. Un XNA monohebra es capaz de transcribirse a DNA gracias a una retrotranscriptasa del HIV modificada. Tras una amplificación convencional por PCR del DNA copia obtenemos nuevamente XNA. Lejos todavía de una verdadera replicación autónoma independiente del DNA, este sistema constituye un gran avance hacia la generación de XNA–XNA polimerasas.

Alternativamente al XNA, la expansión del código genético usando bases nitrogenadas no canónicas supone otra de las promesas dentro de este campo. La expansión del código genético consiste en utilizar el mismo esqueleto del DNA y añadir nuevas bases nitrogenadas que solo pueden ser sintetizadas artificialmente. Estas deben poder ser procesadas por las polimerasas naturales. Idealmente, si las células no reciben dichas bases, el constructo o incluso la célula se debería perder. Trabajos in vitro demuestran que es posible incorporar con polimerasas naturales un tercer par alternativo al DNA. Existen varios pares ya introducidos.5,6 La figura 2B muestra la estructura química del par 7-(2-thienil)imidazo[4,5-b]piridina y 2-nitro-4-propinilpirrol6, los anotados respectivamente como Ds:Px.

 

Figura 2. E(A) Esquema del nucleótido canónico del DNA junto con diferentes variantes de XNA. (B) Estructuras químicas del par de bases nitrogenadas no canónicas (Ds:Px) utilizadas para la expansión del código genético a nivel de DNA junto con sus homólogos naturales (A:T y G:C). Fuente: Adaptadas de Joyce et al.2 y Yamashige et al.7

 

La aproximación es posible gracias al «defecto» de algunas polimerasas a la tolerancia de introducir ácidos nucleicos no convencionales durante el proceso de polimerización. Más recientemente se ha conseguido reproducir estos experimentos in vivo introduciendo bases no canónicas en un plásmido en E. coli permaneciendo durante varias ciclos de replicación y mediante el suministro desde el medio de cultivo de estos xeno-nucleótidos trifosfato.7 En este trabajo observamos cómo los mecanismos de reparación de la célula no son capaces de eliminar dicha incorporación, deduciendo así los autores que la incorporación de dichos elementos al DNA es estable.

Como es de imaginar, la expansión del código genético abre una puerta alternativa al uso de una química ortogonal al nivel de DNA sin necesidad de utilizar polimerasas ortólogas a las naturales. Su utilidad es evidente ya que permite un control sobre la replicación del constructo que contenga estas bases, puesto que siempre dependerán del aporte exógeno de nucleótidos, que son de origen sintético. Sin embargo, queda por resolver qué estrategias permiten aprovechar esta ampliación de código y cómo se deberán procesar en el flujo de información desde RNA a proteínas.

 

Biología alternativa en el proceso de traducción

Aparte de las aproximaciones a nivel del DNA, existe una intensa investigación en el diseño de una biología alternativa en el proceso de traducción. Actualmente, una de las estrategias relacionadas con la síntesis de proteínas es la utilización de aminoácidos artificiales no canónicos para la formación de proteínas en la célula. De forma análoga al uso del XNA, la síntesis biológica de proteínas utilizando moléculas sintetizadas en el laboratorio supone un control más sobre el diseño genético y su liberación. Sin embargo, en el proceso de traducción están involucrados varios elementos que participan en la codificación de la información. Entonces para crear un sistema ortólogo debe existir una ingenierización en relación a los elementos involucrados: el aminoácido (potencialmente no canónico), el tRNA asociado y la aminoácido-tRNA sintetasa que los relaciona.

El tRNA es la molécula que sirve de adaptador entre la información del mRNA codificada en tripletes: los codones, los cuales codifican un aminoácido proteíno-genético o una señal de paro. De forma natural, cada tRNA establece una relación unívoca entre su anticodón y un aminoácido. La molécula encargada de establecer esa relación es un enzima específico que reconoce la región del tRNA y un determinado aminoácido: la aminoácido tRNA sintetasa (aaRS). De forma natural, los codones de paro no tienen asociado un tRNA propiciando el proceso de terminación de la traducción. Sin embargo, existen organismos que son una excepción en el código genético. Estos pueden introducir determinados aminoácidos en señales de terminación de la traducción. Esto es posible ya que contienen un tRNA con un anticodón que complementa con un codón de paro y una aaRS capaz de asociar un aminoácido (por lo general, no convencional) a dicho tRNA. El resultado de tener este par tRNA–aaRS permite introducir aminoácidos donde antes había una señal de parada y además permite proseguir la síntesis proteica. Los casos naturales más estudiados son el TyrRS de Methanocaldococcus jannaschii y los PylRS del género Metanosarcinaceae. Desde un punto de vista aplicado, la cualidad de TyrRS y PylRS radica en que tienen una amplia tolerancia para reconocer aminoácidos –en particular, no canónicos– y relacionarlos con tRNA que complementa con un codón de paro universales.

Basado en este sistema, la creación de un mecanismo ortólogo pasa por reconstituir parejas de tRNA–aaRS en un organismo heterólogo como E. coli, expandiendo el código genético mediante la asignación de un aminoácido a un codón de paro.8Al proceso de reutilización de un codón se le denomina comúnmente emancipación o liberalización de codón. Gracias a la optimización de proteínas se ha conseguido asociar al codón paro ámbar (UAG) un alto número de aminoácidos no convencionales principalmente análogos derivados de Phe y Tyr, utilizando los sistemas de TyrRS y PylRS. Estas estrategias suponen además la novedad de que dichos RS no interfieren en las funciones del resto de los tRNA de la célula huésped. Su función es, por tanto, ortóloga –es decir, no solapante– a la del resto de los tRNA.

En este punto, la ingenierización a través de evolución dirigida de este tipo de moléculas tiene un papel crucial a la hora de promover variantes y sistemas alternativos. Sin embargo, cabe decir que el proceso de asignación de nuevos aminoácidos requiere que los cambios estructura de aaRS permita el reconocimiento de dichas moléculas. Este proceso resulta muy laborioso por lo que los avances en la introducción de nuevos aminoácidos de forma eficiente se esperan limitados a corto plazo.

No obstante, existen otras limitaciones. Si bien hemos asignado un tRNA a un codón de paro, ¿qué pasa con el paro de todas aquellas proteínas del genoma que dependen de esta señal? Este efecto se ha intentado paliar de formas más o menos exitosas. En E. coli,9 la sustitución en el genoma de los 314 codones de paro TAG (que da el codón de paro ámbar UAA) por otros alternativos ha sido una de las aproximaciones. Sin embargo, esta estrategia requiere además delecionar un factor de terminación, el RF1, involucrado en la terminación mediada por el codón de paro ámbar en particular. El problema es que esta deleción afecta a la regulación de la expresión de genes esenciales, haciendo inviable esta alternativa. Por otra parte se ha visto que incrementando los niveles de otro terminador, el RF2, se puede paliar el efecto deletéreo del silenciamiento de RF1.

Mediante esta estrategia se ha conseguido con éxito la lectura de hasta 10 codones UAG en la síntesis de una proteína GFP. El reto ahora consiste en poder introducir más aminoácidos pero –aparte de los esfuerzos de modificación de tRNA para reconocer al aminoácido no canónico– se requiere la emancipación de otros codones. Esto es en principio posible mediante la selección de codones infrecuentes en el genoma huésped, pero conlleva las mismas limitaciones explicadas para la emancipación del UAG comentadas antes. Es evidente que aquí, el tamaño del genoma es un impedimento logístico importante lo que hace que esta alternativa se presente limitada a la hora de ofrecer una solución completa en lo que al diseño de constructos bioseguros se refiere.

 

Doble reto ingenieril

La manipulación de los aaRS no es la única alternativa a una codificación ortóloga a nivel de traducción. Existe una aproximación que no pasa necesariamente por la introducción de nuevos aminoácidos a través de la emancipación de tripletes, sino por la alteración de la pauta de lectura de los codones.

Figura 3. Estructura tridimensional de parte del ribosoma capaz de codificar en cuadrupletes aceptando un tRNA y mRNA (PDB 2J00). Residuos relevantes para la interpretación del mRNA en cuadrupletes están destacados en rojo. Fuente: Adaptada de Neumann et al.10

Esto es posible gracias al diseño de ribosomas ortólogos, capaces de sintetizar una cadena polipeptídica a partir de la codificación mediante cuadrupletes. Esto supone que como la información aparece en grupos de cuatro en vez de tres, ninguna de las 256 combinaciones está libre de asignación a ningún aminoácido. De esta forma se respeta la codificación natural en tripletes añadiendo una capa adicional donde «escribir» nuevo código. Sin embargo, el esfuerzo requiere que no solo el ribosoma sino los tRNA puedan trabajar en una pauta de cuatro nucleótidos. Esto supone un doble reto ingenieril. El trabajo de Neumann et al.10 se basa en la creación de pares aaRS–tRNA ortólogos a los naturales combinados con un ribosoma evolucionado sintéticamente (ribo-Q1) que codifica de forma eficiente series de cuadrupletes utilizando como codón de paro el triplete ámbar (UAG). La figura 3 muestra la estructura tridimensional de uno de estos ribosomas. Sabemos que cualquier alteración en la pauta abierta de lectura es una mutación, ya que anticipa la aparición de codones de paro en la traducción. Este sistema híbrido permite utilizar mRNA ortólogos basado en una codificación distinta, por lo que a pesar de poder utilizar nucleótidos y aminoácidos canónicos, la información se destruye si no se lee en la pauta adecuada. Esto es bidireccional ya que ambos sistemas, el natural de tripletes y el sintético de cuadrupletes, son excluyentes.

Este tipo de aproximación, aun lejos de ser algo de pronta aplicación supone un sistema con un potencial mayor que el basado en la liberalización y reasignación de tripletes.

Una ventaja de este sistema es que es compatible tanto para aminoácidos canónicos como artificiales. El uso de estos últimos ofrecería un doble sistema de control que prevendría la liberación indeseada de un determinado constructo por transferencia horizontal a otros organismos. Idealmente la combinación de un control a nivel de un XNA o DNA ortólogo y las posibles variaciones en el mRNA aún por explorar llevaría a la consolidación de un verdadero flujo de información ortólogo al del DNA-RNA-proteínas. A este nivel, la adquisición de una verdadera biología ortóloga, bien puede pertenecer al dominio de la ciencia ficción, pero el camino está abierto y quedan muchos mundos por explorar.

 

Bibliografía

  1. Clark A.C.: Odisey two (1982). Glasgow: Granada Publishing Ltd., 2010.
  2. Joyce G.F.: Toward an alternative biology. Science 2012; 335: 307-8.
  3. Regot S., Macía J., Conde N., Furukawa K., Kjellén J., Peeters T., Hohmann S., de Nadal E., Posas F., Solé R.: Distributed biological computation with multicellular engineered networks. Nature 2011; 469: 207-11.
  4. Schmidt M.: Xenobiology: A new form of life as the ultimate biosafety tool. Bioessays 2010; 32: 322-31.
  5. Pinheiro V.B. et al.: Synthetic Genetic Polymers Capable of Heredity and Evolution. Science 2012; 336-41.
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  7. Yamashige R., Kimoto M., Takezawa Y., Sato A., Mitsui T., Yokoyama S., Hirao I.: Highly specific unnatural base pair systems as a third base pair for PCR amplification. Proc Natl Acad Sci USA 2012; 40: 2793-806.
  8. Malyshev D.A., Dhami K., Lavergne T., Chen T., Dai N., Foster J.M., Correa I. R. Jr, Romesberg F.E. A semi-synthetic organism with an expanded genetic alphabet. Nature 2014; 509: 385-88.
  9. Hoesl M.G., Budisa N.: Recent advances in genetic code engineering in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology 2012; 23: 751-7.
  10. Neumann H., Wang K., David, L., Garcia-Alai, Chi, J.W. Enconding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 2010; 464: 441-4.

 

Otras referencias

Pinheiro V.B., Loakes D., Holliger P.: Synthetic polymers and their potential as genetic materials.Bioessays 2012; 35: 113-22.


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