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Revista: La metabolómica: un déjà vu por la historia de la bioquímica


Modelización de flujos metabólicos: la era de la fluxómica

El flujo neto de una vía metabólica (la velocidad de producción del metabolito final) está determinado por la velocidad a la que los enzimas y transportadores de la vía catalizan reacciones o facilitan procesos de transporte. Así, el flujo de una vía metabólica es la variable que sirve como indicador de la velocidad de todos sus componentes individuales. La fluxómica es la disciplina de las ómicas que se ocupa del análisis de los flujos metabólicos.

  • Carles Foguet


  • Marta Cascante

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diferencia de otras ómicas, como la transcriptómica, la proteómica o la metabolómica, que proporcionan una visión estática de sistemas biológicos, la fluxómica proporciona información sobre la dinámica del sistema, es decir, de su evolución en el tiempo. Así, por ejemplo, si se cuantifica la transcriptómica, proteómica y metabolómica en una línea celular se obtiene información de los transcritos, proteínas y metabolitos presentes en la muestra en el momento del experimento, pero si se cuantifica la fluxómica es posible inferir cómo cambiará el sistema en el tiempo, por ejemplo, cuánto tardará en duplicarse la línea celular. Es más, se considera que el flujoma, el conjunto de flujos metabólicos en un sistema metabólico, es una manifestación directa del fenotipo metabólico. Consecuentemente, el flujoma es clave para entender cualquier enfermedad con un fuerte componente metabólico, como por ejemplo el cáncer.

A diferencia del transcriptoma, proteoma y metaboloma, que pueden ser cuantificados directamente, el flujoma solo se puede estimar indirectamente mediante la integración en modelos matemáticos de medidas de producción y consumo de metabolitos, datos de transcriptómica, proteómica o metabolómica y/o mapas de distribución de 13C en distintos metabolitos obtenidos a partir de experimentos en que se incuban células con sustratos marcados con 13C. Destacan dos grandes clases de modelos capaces de predecir flujos: loscinéticos y los estequiométricos.

 

Modelos cinéticos

En los modelos cinéticos, un sistema metabólico se describe mediante un sistema de ecuaciones diferenciales de primer orden. Así, para cada metabolito se formula una ecuación diferencial que define su variación en el tiempo. Estas se construyen sumando los flujos que producen cada metabolito y restando los flujos que lo consumen sobre la base de la estequiometría de las reacciones definidas en la red metabólica. En los modelos cinéticos, el flujo de una reacción es función de la concentración de aquellos metabolitos que participan o regulan la reacción. La función matemática, que expresa cómo depende el flujo de una reacción concreta de las concentraciones de metabolitos, se denomina ecuación cinética. En reacciones catalizadas por enzimas, las ecuaciones cinéticas suelen reflejar la cantidad total de enzima, la afinidad de este por los sustratos y su grado de inhibición o activación. La complejidad y número de parámetros asociados a una ecuación cinética depende del detalle con el que se quiera modelar la reacción. Para obtener la máxima correspondencia entre las predicciones del modelo y los datos experimentales, normalmente se realiza un ajuste de los parámetros de las ecuaciones cinéticas. La resolución numérica del sistema de ecuaciones diferenciales permite predecir cómo evolucionan las concentraciones de metabolitos, y por extensión, los flujos (fig. 1).

Figura 1. Ejemplo de un modelo cinético
A) Representación esquemática del sistema metabólico modelado dondeA, B y C son metabolitos y J1J2,J3 y J4 son flujos metabólicos. B) Formulación matemática del modelo cinético. C) Resultado de una simulación con el modelo cinético (asumiendo concentraciones iniciales de 0,5 mM para los metabolitos A, B y C)

 

Dada su estructura dinámica, los modelos cinéticos son ideales para estudiar la evolución del flujoma en el tiempo. Asimismo, permiten incorporar una gran cantidad de detalle, como propiedades cinéticas de enzimas o mecanismos de regulación a corto plazo a través de la construcción de ecuaciones cinéticas específicas.

La principal limitación de los modelos cinéticos radica en la dificultad de construir y parametrizar leyes cinéticas para las distintas reacciones. Esto limita la aplicación de los modelos cinéticos a redes metabólicas de reducidas dimensiones en las que el número de reacciones es relativamente bajo.

 

Modelos estequiométricos

En los modelos estequiométricos, el sistema metabólico se describe como un sistema lineal de ecuaciones e inecuaciones con los flujos metabólicos como variables. Se basan en asumir que el sistema de estudio está en estado estacionario, es decir, en un estado en que las concentraciones de metabolitos son constantes en el tiempo. Esto implica que el sumatorio de los flujos de las reacciones que producen un determinado metabolito debe ser igual al sumatorio de los flujos de reacciones que consumen este mismo metabolito, es decir, que los flujos de producción y de consumo para todos los metabolitos estén balanceados. Adicionalmente, también se puede definir un límite superior e inferior para cada flujo. Estos límites pueden ser usados para incorporar datos experimentales, permitiendo restringir los flujos de consumo y producción de metabolitos a los valores determinados experimentalmente.

El sistema de ecuaciones e inecuaciones juntamente con los límites superiores e inferiores para los flujos sirve para definir un espacio de soluciones, es decir, valores de flujo posibles. Para seleccionar las mejores soluciones dentro de este espacio se suele definir un objetivo biológicamente deseable en el sistema, por ejemplo la maximización de uno o más flujos. El objetivo biológico fijado dependerá del sistema estudiado. Así, en un sistema altamente proliferativo, como una bacteria o célula tumoral, normalmente se asume que «el objetivo» es maximizar el crecimiento. Este objetivo se implementa a través de maximizar la producción de los componentes de la biomasa del organismo, dando a los distintos componentes un peso proporcional a su abundancia. El resultado es la distribución de flujos (flujoma) óptima, es decir, que maximiza la producción de biomasa y por tanto la proliferación bacteriana o tumoral (fig. 2). Esta aproximación se conoce como flux balance analysis

Figura 2. Ejemplo de un modelo estequiométrico
A) Representación esquemática del sistema metabólico del modelo donde A, B, C y D son metabolitos yJ1J2J3J4 y J5 son flujos metabólicos. B) Formulación matemática del modelo estequiométrico. C) Solución óptima del modelo estequiométrico

 

Para construir un modelo estequiométrico solo es necesario conocer la estequiometría del conjunto de reacciones que integran la red metabólica. Por ello, estos modelos permiten integrar un gran número de reacciones e incluso pueden ser construidos automáticamente mediante la información disponible en bases de datos.

Modelos metabólicos de escala genómica

 

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no de los desarrollos más interesantes en fluxómica ha sido el de los modelos metabólicos de escala genómica. Estos modelos contienen todas las reacciones metabólicas que emergen del genoma de un determinado organismo. Además, contienen la asociación gen-proteína-reacción indicando los genes que deben ser expresados para que una determinada reacción esté activa.

Actualmente existen modelos de escala genómica para más de 100 organismos, desde Archaea a mamíferos. Entre ellos destaca el modelo metabólico de escala genómica de humanos Recon 2, el cual contiene 7440 reacciones, 2626 metabolitos y 1789 genes. 

Dado su tamaño, los modelos de escala genómica representan una plataforma ideal para integrar datos de transcriptómica, proteómica y metabolómica. Estos datos tienen un papel clave ya que permiten restringir el espacio de flujos a un espacio que tenga sentido biológico. Por ejemplo, es evidente que aunque el genoma es el mismo en los distintos tejidos de un organismo, la función metabólica de los distintos tejidos será distinta debido a diferentes patrones de expresión génica. Así, la integración de la transcriptómica, proteómica y metabolómica permite reconstruir un modelo específico para un tejido o condición a partir de un modelo no específico (como Recon 2).


«La integración de la transcriptómica, proteómica y metabolómica permite reconstruir un modelo específico para un tejido o condición a partir de un modelo no específico 
(como Recon 2).»

Hay distintos algoritmos capaces de integrar transcriptómica o proteómica, pero en general todos se basan en el mismo principio: si los genes asociados a una reacción están altamente expresados, es más probable que la reacción esté activa en las condiciones de estudio que si los genes están bajamente expresados. Basándose en este principio, los distintos algoritmos buscan maximizar la consistencia entre las medidas de expresión génica y la actividad o inactividad de las reacciones simuladas por el modelo. Recientemente, se han desarrollado también algoritmos para integrar información de metabolómica en estos modelos. Estos algoritmos se basan en el principio de que si un metabolito es detectado en las condiciones de estudio implica que alguna de las reacciones en las que participa tiene que estar activa.

 

Fluxómica asistida por 13C

Independientemente de si se usan modelos cinéticos o modelos estequiométricos, un reto al cuantificar flujos son los grados de libertad asociados al gran número de ramificaciones y ciclos que contiene una red metabólica. El uso de sustratos marcados con 13C, un isótopo estable del carbono, proporciona los medios para reducir esta incertidumbre. Esto es posible porque la conversión de sustratos en productos a través de distintas vías metabólicas resulta en patrones de marca característicos en los intermediarios y los productos metabólicos. Por ejemplo, el piruvato puede ser incorporado al ciclo de Krebs tanto a través de la piruvato deshidrogenasa (PDH) como de la piruvato carboxilasa (PC). Si el piruvato está marcado, por ejemplo debido a la incubación de las células en estudio con glucosa marcada con 13C, estas dos reacciones resultan en un patrón de marca distinto en glutamato. De este modo, si después de una incubación con glucosa marcada con 13C se cuantifica el patrón de marca en glutamato se puede inferir la actividad relativa de la PDH y la PC (fig. 3).

 

Figura 3. Propagación de 13C de [1,2-13C2]-glucosa hasta glutamato
Los círculos representan átomos de carbono, específicamente los grises representan 12C y los círculos de color 13C. Particularmente, los círculos rojos representan 13C que ha entrado en el ciclo de Krebs a través de la piruvato carboxilasa (PC), los círculos amarillos 13C que ha entrado en el ciclo de Krebs a través de la piruvato deshidrogenasa (PDH) y los círculos marrones representan 13C que aún no han entrado en el ciclo de Krebs

En experimentos con marca, resulta clave seleccionar los sustratos marcados en función de los flujos que se quiera cuantificar. Por ejemplo, incubar con [1,2-13C2]-glucosa, uno de los sustratos más usados, proporciona información sobre los flujos en glicólisis, vía oxidativa y no oxidativa de pentosas fosfato y oxidación y carboxilación del piruvato.

En lo referente a la cuantificación experimental de la marca, hay dos grandes métodos, la resonancia magnética nuclear (RMN) y la espectrometría de masas (MS). La RMN tiene la ventaja que es capaz de distinguir entre isotopómeros de un mismo metabolito, es decir, isómeros con sustituciones de 13C en posiciones específicas. Sin embargo, tiene la limitación que requiere una gran cantidad de muestra y los resultados son complejos de analizar. Por otra parte, la MS tiene la ventaja que requiere menos cantidad de muestra y los datos son más fáciles de analizar que con la RMN. Además puede ser acoplada a un cromatógrafo líquido o de gas permitiendo obtener altas resoluciones. No obstante, la MS tiene la limitación que solo distingue entre isotopómeros de masa, es decir, isotopómeros con un mismo número de sustituciones de 13C.

Para integrar los datos experimentales de marca, se busca la distribución de flujo que mejor reproduce los patrones de marca determinados experimentalmente en distintos metabolitos del sistema estudiado. Para ello se usan modelos cinéticos o estequiométricos, acoplados a un modelo que calcula la distribución de isotopómeros y permite simular la propagación de marca a través del sistema.

Un factor clave a considerar es si la marca está en estado estacionario isotópico o no. En estado estacionario isotópico, las abundancias de isotopómeros e isotopómeros de masa pueden ser calculadas como función de la distribución de flujos y la marca en los sustratos, permitiendo simplificar el problema. Sin embargo, la distribución de isotopómeros puede tener un tiempo de transición alto, particularmente en aquellos metabolitos que se encuentran en cantidades elevadas en el interior de las células, como por ejemplo el glucógeno, y este tiempo puede ser mayor que el tiempo del experimento. En estos casos, se deben usar aproximaciones matemáticas más complejas.

«En los últimos años, la fluxómica basada en 13C ha demostrado su gran potencial para caracterizar el flujoma en distintos tipos celulares y condiciones.»

Entre ellas destaca la del software IsoDyn, desarrollado en el grupo de la Dra. Marta Cascante, que consiste en un modelo cinético acoplado a un modelo dinámico de isotopómeros. El modelo de propagación de marca de IsoDyn consiste en un sistema de ecuaciones diferenciales análogo al de un modelo cinético pero con la particularidad de que es capaz de predecir la evolución de la concentración de isotopómeros.

En los últimos años, la fluxómica basada en 13C ha demostrado su gran potencial para caracterizar el flujoma en distintos tipos celulares y condiciones. En particular, un campo en el que ha sido ampliamente usada ha sido en el estudio de la reprogramación metabólica que presentan las células tumorales. Caracterizar esta reprogramación resulta clave para identificar vulnerabilidades que puedan ser explotadas en terapia. Sin embargo, la fluxómica con 13C tiene la limitación que resulta difícil de aplicar en modelos de grandes dimensiones. Consecuentemente, no es factible aplicar esta técnica en modelos de escala genómica sin reducir previamente el número de reacciones del modelo al mínimo esencial.

 

Perspectivas de futuro

En este artículo se han descrito las dos grandes aproximaciones para estudiar la fluxómica, los modelos cinéticos y los modelos estequiométricos, cada una con sus ventajas y limitaciones. Asimismo, también se han descrito los principios de la fluxómica de 13C y su gran utilidad en la determinación de flujos metabólicos.

El desafío de la fluxómica para la próxima década es crear una nueva aproximación híbrida que sea capaz de integrar modelos cinéticos con modelos de escala genómica, combinando así las ventajas de estas dos aproximaciones, y que además sea compatible con técnicas de fluxómica asistida por 13C.

Por último, vale la pena señalar que la tendencia actual y futura es la de facilitar el intercambio libre de los datos flujómicos generados entre la comunidad científica. La consecución de este objetivo requiere la generación de estándares internacionales, bases de datos de información flujómica e infraestructuras electrónicas que faciliten la diseminación de los datos obtenidos. La iniciativa europea COSMOS (EC312941) desempeña un papel fundamental en este proceso, que tiene una gran importancia para la correcta gestión y aprovechamiento de la ingente cantidad de datos que se generan en los estudios flujómicos y metabolómicos.

 

 

Bibliografía general

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