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Revista: Enfermedades raras


Investigación en enfermedades raras: una vía de dos sentidos

La rareza de una enfermedad alude, obviamente, a su frecuencia en la población. En Europa consideramos raras aquellas enfermedades con una prevalencia ≤ 2.000 nacimientos. Es decir, no más de 260.000 enfermos en la Unión Europea, donde habitan 508 millones de personas. 

  • Manuel Palacín

  • Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRB). Centro de Investigación en Red de Enfermedades Raras (CIBERER) Departamento de Bioquímica y Biomedicina Molecular de la Universitat de Barcelona

Las enfermedades raras hereditarias tienen fundamentalmente una herencia monogénica, y por tanto presentan herencia Mendeliana. Las primeras fueron descubiertas a principios del siglo XX por Sir Archibald Garrod al describir los primeros errores congénitos del metabolismo. Actualmente en la base de datos Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) están descritas las características fenotípicas de unos 10.000 trastornos monogénicos (www.omim.org). Los genes responsables se han descrito solo en menos de la mitad de estos trastornos.

 

Los primeros genes responsables de estas enfermedades fueron identificados mediante la estrategia del gen candidato (conocida la función fisiológica alterada se identifica el gen responsable) (Figura 1). Ejemplo claro de la estrategia del gen candidato fue la identificación de mutaciones en el gen de la beta-globina causantes de la anemia falciforme a mediados del siglo pasado, primero mediante secuenciación directa de proteína y posterior identificación de la mutación responsable tras el desarrollo de la tecnología de DNA recombinante1 . Con la estrategia del gen candidato se han identificado varios cientos de genes y las mutaciones responsables de trastornos monogénicos. Entre estos podemos destacar la identificación de los genes que subyacen a dos de los errores congénitos del metabolismo descritos por Garrod, alcaptonuria y cistinuria a mediados de los años 90 del pasado siglo por laboratorios españoles, el de Santiago Rodríguez de Córdoba, Virginia Nunes y el nuestro. La cistinuria es una enfermedad hereditaria rara con herencia recesiva que afecta principalmente al riñón y que provoca cálculos en el sistema urinario. 

 

 

 

La identificación de mutaciones en el gen SLC3A1 causantes de cistinuria representó una vía de conocimiento de dos sentidos (Figura 1). En un sentido, se identificó la proteína codificada por SLC3A1 (rBAT), que es una de las proteínas cuya pérdida de función causa la enfermedad (del gen/proteína a la enfermedad) (Figura 2). Este conocimiento ha permitido la identificación de 133 mutaciones que explican 579 alelos mutados en pacientes de 23 países, y se ha desarrollado un modelo de ratón con ablación del gen Slc3a1 como avatar en ratón de la cistinuria humana que se está utilizando para el desarrollo de nuevas terapias anti-litiasis de cistinuria2 . Visto desde el otro sentido, estos hallazgos representaron la identificación del primer gen y proteína responsables en el proceso de reabsorción renal de aminoácidos (Figura 2).

 

En la década de los 80 del siglo pasado se desarrolló una estrategia que ha permitido la identificación de genes por desequilibrio de ligamiento (o ligamiento genético) sin información funcional previa del gen. Marcadores a lo largo del genoma (p.ej., microsatélites) se utilizan para delimitar regiones genómicas que co-segregan con la enfermedad en grupos familiares de acuerdo con su herencia recesiva o dominante. En la región genómica identificada se encuentra el gen responsable, focalizando la búsqueda entre unos pocos a varias decenas de genes. Una estrategia mixta de ligamiento genético y gen candidato permitió la identificación del segundo gen de cistinuria, SLC7A9, que codifica para el transportador de aminoácidos b0,+AT (Figura 2). De nuevo una vía de conocimiento de doble sentido. La identificación de SLC7A9 como segundo gen de cistinuria ha permitido identificar 95 mutaciones en 436 alelos de pacientes de 18 países. Así, bien por mutaciones en SLC3A1 o por mutaciones en SLC7A9 se explica el 85% de los alelos responsables de la cistinuria en los pacientes estudiados2 .El 15% de los alelos que falta por explicar podrían ser debidos a mutaciones en regiones no estudiadas de ambos genes (p.ej., regiones no codificantes) o a variantes genómicas en un tercer gen (ver más adelante). En el otro sentido del camino conceptual que conecta enfermedad rara con función alterada, la demostración de SLC7A7 como gen de cistinuria ha permitido identificar el transportador que dimeriza con rBAT. El heterodímero b0,+AT/rBAT intercambia cistina y aminoácidos básicos por aminoácidos neutros (Figura 2A). 

 

Las mutaciones que provocan la pérdida de función del holotransportador b0,+AT/rBAT causan hiperexcreción de cistina y de aminoácidos catiónicos en la orina, pero no la de otros aminoácidos neutros. De nuevo la cistinuria (enfermedad rara) nos ilustra sobre cómo funciona este transportador en el riñón al indicarnos cuál es el sentido del intercambio de aminoácidos a través del transportador: cistina y aminoácidos catiónicos entran en la célula desde el lumen del túbulo renal, intercambiándose con otros aminoácidos neutros, que salen de la célula al lumen del túbulo renal a través de la membrana plasmática apical de las células epiteliales (Figura 2A). El acúmulo de cistina, aminoácido de baja solubilidad, en el lumen a lo largo de la nefrona, uréter y vejiga conduce a su precipitación, causando cálculos de cistina, siendo esta litiasis el único mecanismo de patología en la enfermedad. La proteína rBAT es necesaria para el tráfico del holotransportador a la membrana, mientras que b0,+AT es la subunidad transportadora. Mutaciones con pérdida de función en rBAT causan generalmente problemas de expresión en la membrana plasmática, mientras que mutaciones con pérdida de función en b0,+AT causan tanto problemas de expresión como defectos en el mecanismo molecular del transportador2 . De nuevo, como veremos más adelante, la enfermedad rara (mutaciones de cambio de aminoácidos (“missense”) nos informa sobre la relación estructura-función de las proteínas afectadas.

 

Hoy sabemos que la mayor parte de la cistina reabsorbida por el túbulo renal lo hace por mediación del heterodí- mero b0,+AT/rBAT que se encuentra en la membrana apical de las células epiteliales situadas en el comienzo del túbulo renal (túbulo contorneado proximal) (Figura 2A). En el otro extremo del túbulo renal proximal (en la parte recta) se encuentra otro heterodímero de rBAT, el holotransportador AGT1/rBAT (Figura 2B). 

 

AGT1 (codificado por el gen SLC7A13) intercambia cistina por glutamato o aspartato y se cree que es responsable de la reabsorción de la cistina que queda en el túbulo proximal tras la reabsorción mediada por b0,+AT/rBAT (actuaría como una aspiradora de cistina para eliminar el remanente). La participación de b0,+AT, un intercambiador de aminoácidos, en un proceso activo como es la reabsorción renal de aminoácidos por la que el 96-99% de los aminoácidos filtrados en el glomérulo es reabsorbido por el túbulo renal fue una sorpresa que caló en la comunidad científica por el impacto patológico de las mutaciones causantes de pérdida de función de rBAT y b0,+AT. Hoy pensamos que el funcionamiento acoplado con transportadores secundarios que utilizan el gradiente electroquímico de Na+ para acumular aminoácidos neutros (B0 AT1) o aniónicos (EAAC1) permite la acumulación de cistina mediada por b0,+AT y AGT1 respectivamente (Figura 2A-B). Variantes genómicas (raras o polimorfismos) podrían estar en la base de los alelos de cistinuria que no se han explicado todavía por mutaciones en SLC3A1 o SLC7A9, pero esto todavía no ha sido demostrado. 

 

Las estrategias de gen candidato y ligamiento genético han permitido identificar un tercio de los genes cuyas mutaciones son responsables de los trastornos monogé- nicos. De hecho, con estas estrategias se han identificado los genes que subyacen a todas las aminoacidurias hereditarias debidas a defectos en el túbulo renal, es decir las aminoacidurias primarias hereditarias (Figura 2). A partir de ahora, si queremos saber más sobre la base molecular de la reabsorción renal de aminoácidos, es decir qué transportadores participan, sólo podemos generar modelos animales de ablación de genes y estudiarlos, porque nos hemos quedado sin aminoacidurias primarias a las que asociar su transportador defectuoso. Probablemente la redundancia/complementación de transportadores, y en menor grado la posible letalidad embrionaria sean las causas de que no se hayan descrito más aminoacidurias primarias hereditarias. 

 

Las nuevas técnicas de secuenciación han acelerado la identificación de los genes que subyacen a las enfermedades raras hereditarias1 . Estas nuevas técnicas de secuenciación masiva en paralelo permiten identificar los genes relacionados con las enfermedades raras hereditarias sin necesidad de tener genes candidatos y sin disponer de familias informativas (muchas familias o suficientemente grandes) para utilizar ligamiento genético. Básicamente son necesarios tríos (padres e hijo). Tanto la secuenciación completa del genoma (Whole-Genome Sequence; WGS) como la secuenciación de exomas (Whole-Exome Sequence; WES) son cada vez más asequibles y de coste más reducido (algo más de 1000 € por WGS con una cobertura de 30x, que se considera necesaria para identificar todas las variantes). WGS a escala poblacional hoy es una realidad. La gran mayoría de las variantes de secuencia causantes de enfermedades raras se encuentran en la parte codificante de proteínas del genoma. Es decir, en 30-60 millones de nucleótidos, el 1-2% de los 3 mil millones de nucleótidos de nuestro DNA. Se pueden abaratar incluso más los costes focalizándose en el conjunto de exomas del genoma (WES). El primer trastorno monogénico resuelto por WES fue el que subyace al síndrome de Miller, un trastorno de malformación múltiple1 . El principal problema de la identificación de genes por secuenciación masiva (WGS o WES) corresponde a la identificación de las variantes causantes de enfermedad entre todas las variantes que se encuentran entre dos personas cualesquiera: aproximadamente 20.000 por término medio entre dos WES y unos 4.000.000 entre dos WGS1 . Naturalmente, la mutaciones con clara pérdida de función como codones de parada, cambio del marco de lectura, etcétera, permiten identificar más fácilmente las variantes funcionales. Se ha estimado que un genoma humano contiene 100 variantes causantes de pérdida de función que inactivan unos 20 genes y, sin embargo, solo una pequeña proporción de estas variantes son causa de una enfermedad recesiva. De nuevo, la cosegregación con la enfermedad, a ser posible en varios tríos en estudio, y cierto conocimiento de la fisiopatología de la enfermedad, permiten identificar los genes causantes de la misma entre los muchas variantes de significado desconocido (VUS por Variant of Unknown Significance). La posterior confirmación por secuenciación dirigida con el método de Sanger automatizado, y la valoración funcional del impacto del gen mutado en la fisiopatología de la enfermedad (es decir, en estudios funcionales en sistemas celulares o en animales modelo) establecen definitivamente la relación causal de las variaciones en el gen con la enfermedad. 

 

La abundante información que se está generando permite conectar por primera vez distintas vías metabó- licas (p.ej., conexión entre el ciclo metionina/homocisteina y el metabolismo de adenosina a través de la deficiencia en adenosina quinasa), la identificación de genes nucleares con impacto en el funcionamiento de la mitocondria (p.ej., dependencia de la actividad metabólica de la acilglicerol quinasa (AGK) mitocondrial con respecto al tráfico a la membrana mitocondrial interna del intercambiador para ADP/ATP, ANT1, en un subgrupo de pacientes de síndrome de Senger)1 . De nuevo, la vía de doble sentido, los genes subyacentes a enfermedades monogénicas nos muestran su papel funcional y este conocimiento acelera la identificación de nuevos genes de enfermedades con características clínicas semejantes (Figura 1). 

 

La identificación de variantes que ocasionan cambio de residuo de aminoácidos en la proteína que codifican (variantes missense) ofrece otro torrente de información bioquímica que nos ayuda a comprender las relaciones estructura-función de las proteínas implicadas. Son literalmente mutaciones que nos ilustran sobre los mecanismos moleculares de las máquinas a escala nanométrica que son las proteínas. Tomemos dos ejemplos, mutaciones en el primer enzima del ciclo de la urea, carbamil fosfato sintetasa 1 (CPS1)3 y mutaciones en las subunidades SLC7 de los transportadores heteroméricos de aminoá- cidos (HATs)4 . Mutaciones en CPS1 causan un trastorno congénito grave del ciclo de la urea. CPS1 cataliza la formación de carbamilfosfato (H2 NCO2 PO3 2-) a partir de amonio (NH3 ) y bicarbonato (HCO3- ) con consumo de dos moléculas de ATP, que dan dos de ADP, una de fosfato y el grupo fosforilo del carbamil fosfato. Se trata de la entrada directa y primera de amonio en el ciclo para la producción de urea. La estructura de CPS1 contiene varios dominios catalíticos además de un dominio de unión del principal activador alostérico del enzima, N-acetyl-L-glutamato (NAG), y un dominio central de función previamente desconocida (UFSD). La presencia de NAG es necesaria para activar CPS1 y se han descrito varias mutaciones puntuales que disminuyen la afinidad por NAG, que por un lado explican funcionalmente la interacción del enzima con el activador y por otro lado muestran que la suplementación terapéutica con análogos estables de NAG puede ser beneficiosa para estos pacientes. Por otro lado se ha identificado una agrupación de mutaciones en el dominio central UFSD. El estudio funcional de estas mutaciones ha mostrado que causan defectos de plegamiento, inestabilidad y baja expresión, revelando su función como integrador estructural de los dominios funcionales del enzima. 

 

 

Miembros de la familia de proteínas SLC7 corresponden a las subunidades “catalíticas” de los HATs. Son ocho los transportadores SLC7 en humanos. Se han descrito una total de 49 mutaciones “missense” en transportadores SLC7 en cistinuria (b0,+AT, ya descrito más arriba), lisinuria con intolerancia a proteínas (y+ LAT1), síndrome asociado a autismo (LAT1), pérdida de audición relacionada con la edad (LAT2) y en otros transportadores de la familia asociados a otras enfermedades (en estudio). Estos transportadores tienen algo más de 400 residuos de aminoácidos. Conocemos variantes en más del 10% de estos residuos que causan pérdida de función de dichos transportadores. Los transportadores SLC7 presentan el plegamiento de tipo LeuT, uno de los más populares entre transportadores de solutos y principalmente con 12 segmentos transmembrana, como se ha evidenciado al resolver la estructura cristalina de transportadores bacterianos homólogos5 y más recientemente de un transportador bacteriano de la misma familia. Estas estructuras revelan una concentración de mutaciones “missense” en el entorno del lugar de unión del sustrato (en el entorno de los fragmentos no plegados de las hélices transmembrana 1 y 6) (Figura 3). Sorprendentemente, también hay una concentración de mutaciones en el entorno del bucle que une las hélices transmembrana 8 y 9, sugiriendo un papel para esta región de la proteína en el mecanismo de transporte o en su estabilidad, y que por lo tanto merecen ser estudiados. Finalmente, casi el 40% de las variaciones missense causantes de enfermedad ocurren en residuos no conservados, focalizando la atención en residuos específicos relevantes para cada transportador dentro de la familia SLC7. 

 

El horizonte de la investigación en enfermedades raras hereditarias es espectacular. La llegada de la secuenciación masiva en paralelo está revelando una gran cantidad de genes y mutaciones causantes de enfermedad, con el horizonte de identificar los genes que subyacen a 10.000 enfermedades raras hereditarias. Es a la vez una época brillante para el avance del diagnóstico de los enfermos y por otro lado un reto en disecar los mecanismos de patología. De nuevo los dos sentidos en esta vía del conocimiento con un objetivo claro, el desarrollo de terapias. En este sentido IRDIRC (International Rare Diseases Research Consortium) tiene el objetivo de desarrollar para el año 2027 al menos 1.000 nuevas terapias de enfermedades raras. ¡Ojalá seamos capaces de cumplir con ese objetivo!

 

PARA LEER MÁS

1. Stranneheim H & A. Wedell A (2016). Exome and genome sequencing: a revolution for the discovery and diagnosis of monogenic disorders. Journal of Internal Medicine 279: 3-15.

2. Chillarón J, Font-Llitjós M, Fort J, Zorzano A, Goldfarb DS, Nunes V, Palacín M (2010). Pathophysiology and treatment of cystinuria. Nat Rev Nephrol. 6(7):424-34.

3. Díez-Fernández C, Gallego J, Häberle J, Cervera J and Rubio V (2015). The Study of Carbamoyl Phosphate Synthetase 1 Deficiency Sheds Light on the Mechanism for Switching On/Off the Urea Cycle. J Genet Genomics. 42(5):249-60.

4. Bröer S, Palacín M (2011). The role of amino acid transporters in inherited and acquired diseases. Biochem J. 436(2):193-211.

5. Kowalczyk L, Ratera M, Paladino A, Bartoccioni P, Errasti-Murugarren E, Valencia E, Portella G, Bial S, Zorzano A, Fita I, Orozco M, Carpena X, Vázquez-Ibar JL, Palacín M (2001). Molecular basis of substrate-induced permeation by an amino acid antiporter. Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Mar 8;108(10):3935-40. 


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