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Revista: Técnicas de imagen


Criomicroscopía correlativa tridimensional de tomografía de rayos X blandos

El proceso de adquisición de un tomograma puede realizarse en pocos minutos y genera así un alto rendimiento en la adquisición de los datos que permite la extracción de información estadística y cuantitativa de la cartografía celular 3D.

  • José Javier Conesa

  • Departamento de Estructura de Macromoléculas, Centro Nacional de Biotecnología [Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)], Madrid, España

  • Francisco Javier Chichón

  • Departamento de Estructura de Macromoléculas, Centro Nacional de Biotecnología [Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)], Madrid, España

INTRODUCCIÓN

En el campo de la biología celular estructural, una caracterización de los diferentes componentes celulares se hace necesaria para comprender los procesos biológicos a nivel de célula completa. En este contexto, la microscopía de luz visible (VLM) provee de información de la cartografía celular mediante el uso de marcadores fluorescentes específicos de distintas estructuras. La aparición de nuevos métodos de microscopía de luz visible con resoluciones que superan el límite de difracción ha revolucionado el campo en los últimos años. No obstante, la necesidad del empleo de marcadores fluorescentes para la identificación de estructuras limita su identificación en un contexto global de la célula. Otra de las metodologías de uso habitual que permite el acceso a la estructura celular es la microscopía electrónica de transmisión (TEM). Esta técnica, pese a proporcionar un detalle de los orgánulos celulares de una resolución superior (próxima a 2 nm) a la VLM y visualizar las estructuras en un contexto celular, requiere para su empleo una preparación de muestras que implica la fijación química de las células, su deshidratación y la tinción de las mismas con metales pesados, lo que induce una serie de distorsiones de la estructura celular. Además, la capacidad de penetración de los electrones y la adquisición de las imágenes en vacío implica un limitado grosor de la muestra (aproximadamente 200-300 nm) que es inferior al tamaño de una célula completa (5-10 µm). Esto lleva a que las células han de ser incluidas en una resina que permita su seccionamiento a los grosores adecuados con los consecuentes artefactos asociados y la perdida de la información en un contexto celular global. Actualmente en TEM, la fijación por vitrificación del agua de las células (por congelación ultrarrápida o a alta presión) ha conseguido eliminar los artefactos relacionados con la preparación de la muestra obteniendo información muy cercana a las condiciones nativas de la célula. Sin embargo, el límite de penetración de los electrones (aproximadamente 300 nm y dependiendo del sistema óptico) fuerza a que la muestra tenga que ser adelgazada a grosores de esas dimensiones, lo que en condiciones de vitrificación de las células requiere de equipos no convencionales.

 

 

 

En biología estructural, la correlación de información proveniente de diferentes técnicas de imagen provee de información valiosa que no puede ser obtenida por las distintas técnicas de forma individual. En concreto, la correlación entre la VLM y la TEM permite, por ejemplo la localización de eventos concretos y su caracterización a alta resolución, utilizando TEM de secciones ultrafinas de células embebidas en resina o bien la criotomografía electrónica, la cual proporciona esta información en condiciones cercanas a las nativas. A pesar de ello, la diferencia de resolución y acceso al contexto celular existentes entre las dos técnicas y las limitaciones inherentes a cada una de ellas dificultan la aplicación de esta metodología. Para resolver esta limitación, se puede utilizar criotomografía de rayos X blandos (crio-SXT), una técnica de microscopía de transmisión que utiliza como fuente de energía rayos X, y que permite la reconstrucción tridimensional de células completas (hasta 15 µm) con una resolución espacial nanométrica (entre 30 y 50 nm dependiendo de la lente objetivo utilizada) y en condiciones cercanas a las nativas. La crio-SXT proporciona pues información estructural que se encuentra en una situación intermedia en términos de resolución entre la VLM y la TEM, lo que permite rellenar la brecha de resolución existente entre las dos y proveer información complementaria a nivel de orgánulos celulares. Respecto a las muestras empleadas en crio-SXT, la alta capacidad de penetración de los rayos X permite la adquisición de imágenes de células completas, sin necesidad de realizar secciones y en condiciones de vitrificación, lo que limita los artefactos relacionados con la preparación de muestras que se producen en la TEM de secciones ultrafinas de muestras embebidas en resina. En la crioSXT, la energía incidente de los rayos X empleada es de 520 eV, energía que se encuentra en la denominada ventana del agua, que comprende las energías que van desde el borde de absorción del oxígeno (284 eV) y el del carbono (543 eV) (Figura 1). En este rango de energías el oxígeno, presente principalmente en el agua de la célula, absorbe muy poca radiación, es transparente, y por el contrario el carbono, presente principalmente en las membranas y proteínas celulares, absorbe mucho. Este hecho confiere a las muestras biológicas un contraste de absorción en la célula que hace posible la adquisición de imágenes sin necesidad de emplear agentes de tinción. El esquema de adquisición de imágenes que se sigue en crio-SXT es un esquema de adquisición tomográfico idéntico al de la tomografía electrónica (véase artículo “Criotomografía electrónica” en este mismo número); es decir, que las células vitrificadas se montan en el portamuestras del microscopio que tiene la capacidad de rotar, adquiriéndose proyecciones de las células a distintos ángulos de inclinación. Las imágenes a los distintos ángulos son entonces empleadas para reconstruir un volumen de la célula que contiene información tridimensional (3D) de la distribución de los orgánulos (Figura 2). El proceso de adquisición de un tomograma puede realizarse en pocos minutos y genera así un alto rendimiento en la adquisición de los datos que permite la extracción de información estadística y cuantitativa de la cartografía celular 3D.

 

 

Otra de las propiedades del haz incidente de rayos X empleado en crio-SXT es la modulación de su energía. Al variar esta, los elementos constituyentes de la muestra absorben la radiación de forma diferente. Esta propiedad se puede utilizar para identificar de forma inequívoca y específica distintos elementos en el contexto celular mediante la generación de imágenes de contraste obtenidas por combinación de imágenes a dos energías diferentes, una imagen a una energía a la que para un determinado elemento la absorción se incrementa rápidamente (borde de absorción que está determinado por la estructura electrónica del elemento) y otra a una energía previa a este cambio de absorción. Estas imágenes de contraste pueden ser tomadas siguiendo un esquema de adquisición tomográfico de forma que se pude recuperar la distribución elemental 3D en el contexto celular. Esta técnica espectroscópica 3D ha sido empleada por ejemplo para el estudio del Ca2+ intracelular (borde de absorción L del Ca, 350 eV) y para el estudio de la acumulación intracelular de nanopartículas de óxido de hierro (borde de absorción K del Fe, 709 eV).

 

MICROSCOPÍA CORRELATIVA Y CRIOTOMOGRAFÍA DE RAYOS X BLANDOS

Como se ha mencionado, la crio-SXT proporciona información estructural a nivel de célula completa sin necesidad de utilizar agentes de tinción y en condiciones próximas a las nativas. No obstante, la identificación de eventos concretos en el concurrido entorno celular puede ser compleja. Con el propósito de facilitar la localización de los eventos una aproximación correlativa entre crio-SXT y VLM, tanto antes como después de la vitrificación de las células, se ha aplicado a distintos tipos de muestras como virus aislados, algas, levaduras, protozoos, parásitos intracelulares y células de mamífero. 

 

Para llevar a cabo esta aproximación correlativa (Figura 2) las células son crecidas o depositadas en un soporte marcado con coordenadas y compatible con las dos técnicas para poder correlacionar la información (p.ej. una rejilla de microscopía electrónica de oro). Antes del proceso de vitrificación, las muestras se analizan por VLM para la localización de eventos de interés en las células vivas. Posteriormente a la vitrificación de la muestra, ésta se analiza por criomicroscopía de luz visible (crio-VLM) con el propósito de volver a localizar los eventos ya identificados previamente o bien para determinar sus coordenadas en el caso de no haberse realizado con anterioridad. En ambos casos la información obtenida por crio-VLM es útil para identificar las mejores muestras para ser transferidas al microscopio de crio-SXT ya que las muestras pueden ser dañadas durante el proceso de vitrificación o su manipulación.

 

 

Entre las técnicas de VLM que se han empleado en esta aproximación correlativa se encuentran la microscopia de crioepifluorescencia, la microscopía óptica estocástica de reconstrucción (STORM) o la microscopía de iluminación estructurada 3D (SIM). Algunos de los procesos biológicos que se han estudiado por esta metodología correlativa se encuentran la interacción patógeno-hospedador, el estudio de estructuras celulares en situaciones patológicas, el estudio de la condensación de la cromatina en distintos estadios de desarrollo celular o la internalización de nanopartículas (Figura 3).

 

Otras aproximaciones correlativas con otras técnicas de microscopía también son posibles, habiéndose desarrollado por ejemplo métodos correlativos con microscopía de fluorescencia de rayos X de alta energía (Hard X-ray fluorescence, XRF). La XRF es una técnica basada en radiación sincrotrón que permite la adquisición de imágenes de elementos químicos a alta resolución espacial (aproximadamente 25 nm) y con muy alta sensibilidad (ppb). Además, esta técnica puede realizarse en condiciones criogénicas lo que permite el análisis de las mismas muestras medidas por crio-SXT sin necesidad de un procesamiento adicional de las mismas. De esta forma, la información elemental recuperada por XRF puede ser estudiada en el contexto de la ultraestructura celular obtenida por crio-SXT accediendo a información que no es posible obtener de otra forma. Esta aproximación correlativa ha sido de utilidad en el estudio de cristales de hemozoina en vacuolas digestivas del parásito intra-eritrocítico Plasmodium falciparum. Otras posibles aplicaciones de esta aproximación son la localización intracelular de compuestos organometálicos o de nanomateriales.

 

Otra aproximación correlativa adicional es la desarrollada utilizando microscopía de luz visible y técnicas tomográficas (crio-ET) (ver artículo “Criotomografía electrónica” en este mismo número). Este método permite estudiar los eventos localizados por VLM a una muy alta resolución mediante la técnica de crio-ET. Por otro lado, la correlación de crio-SXT con técnicas de TEM convencionales, es decir TEM de secciones ultrafinas de muestras embebidas en resina, implica un procesamiento adicional de la muestra posterior a la adquisición de datos de crio-SXT que dificulta en gran medida la obtención de resultados. Más prometedora es la posibilidad de correlacionar la información obtenida por crio-SXT con TEM en condiciones de criogenia. Esta aproximación permite acceder a información estructural de muy alta resolución (subnanométrica), obtenida por el análisis de imágenes en criotomografía electrónica, en un contexto celular completo proporcionado por la crio-SXT. Para ello la muestra celular, una vez analizada por crio-SXT, ha de ser adelgazada a un grosor que permita la transmisión de los electrones. Esto se consigue mediante la aplicación de la microscopía de haz de iones focalizados y la microscopía de barrido en condiciones criogénicas (crio-FIB/SEM), recientemente aplicada a muestras biológicas. No obstante, esta metodología aún no ha sido desarrollada plenamente.

 

CONCLUSIONES

En conjunto, la crio-SXT se posiciona como una técnica que permite la integración en un contexto celular completo, a resolución espacial nanométrica, de forma cuantitativa y en condiciones próximas a las nativas, de información proveniente de otras técnicas de biología estructural, como son la información de alta resolución de TEM, la información funcional de VLM o la señal elemental de XRF. En los próximos años, el establecimiento de nuevos desarrollos técnicos como la automatización en el procesamiento de muestras, datos y correlación de información proveniente de distintas técnicas o la integración de crio-SXT con otras técnicas van a hacer de la crio-SXT una técnica de biología estructural muy popular para el estudio de la célula. 

 

PARA LEER MÁS

Carrascosa JL, Chichón FJ, Pereiro E, Rodríguez MJ, Fernández JJ, Esteban M, Heim S, Guttmann P, Schneider G. Cryo X-ray tomography of vaccinia virus membranes and inner compartments. Journal of Structural Biology 168 (2009) 234-9

Chiappi M, Conesa JJ, Pereiro E, Sánchez Sorzano CO, Rodríguez MJ, Henzler K, Schneider G, Chichón FJ, Carrascosa JL. Cryo-soft X-ray tomography as a quantitative threedimensional tool to model nanoparticle:cell interaction. J. of Nanobiotechnology (2016) 14:15.

Chichón FJ, Rodríguez MJ, Pereiro E, Chiappi M, Perdiguero B, Guttmann P, Werner S, Rehbein S, Schneider G, Esteban M, Carrascosa JL. Cryo nano-tomography of vaccinia virus infected cells. Journal of Structural Biology 177 (2012) 202-11.

Conesa JJ, Otón J, Chiappi M, Carazo JM, Pereiro E, Chichón FJ, Carrascosa JL. Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography. Sci Rep. 6 (2016) 22354.

Kapishnikov S, Grolimund D, Schneider G, Pereiro E, McNally JG, Als-Nielsen J, Leiserowitz L. Unraveling heme detoxification in the malaria parasite by in situ correlative X-ray fluorescence microscopy and soft X-ray tomography. Sci Rep 7 (1) (2017) 7610.

Varsano N, Dadosh T, Kapishnikov S, Pereiro E, Shimoni E, Jin X, Kruth HS, Leiserowitz L, Addadi L. Development of correlative cryo-soft X-ray tomography and stochastic reconstruction microscopy. A study of cholesterol crystal early formation in cells. JACS 138 (2016) 14931-40. 


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