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Revista: Biología Epitelial


Búsqueda computacional de compuestos activos para el tratamiento de alteraciones cutáneas

UNO DE LOS SIGNOS MÁS LLAMATIVOS, del envejecimiento cutáneo es la aparición de arrugas, que aparecen de forma natural con el paso del tiempo (arrugas finas, rugosidad superficial, sequedad y debilidad de la piel), y se correlacionan con cambios bioquímicos, histológicos y fisiológicos. 

  • Clara Blanes-Mira

  • Instituto de Investigación, Desarrollo e Innovación en Biotecnología Sanitaria de Elche (IdiBE). Universidad Miguel Hernández, Elche (Alicante)

  • Gregorio Fernández-Ballester

  • Instituto de Investigación, Desarrollo e Innovación en Biotecnología Sanitaria de Elche (IdiBE). Universidad Miguel Hernández, Elche (Alicante)

La piel es un órgano sensorial que actúa como barrera entre el organismo y el entorno, impidiendo las infecciones y la pérdida de agua, y sirve como protección contra el calor, la luz y las lesiones, además de almacenar agua y grasa y regular la temperatura corporal. Los problemas de la piel son, en líneas generales, bastante frecuentes y los motivos de su aparición muy variados. Cualquier agente que irrite, obstruya o inflame la piel puede causar síntomas como enrojecimiento, hinchazón, ardor y picazón. Los más comunes son dermatitis atópica, prurito, acné, psoriasis, rosácea, hiperhidrosis, y un largo etcétera causado por infecciones, factores genéticos, factores ambientales y la combinación de todos ellos.

 

Para todos los problemas que pueden afectar a la piel existen modelos de regulación de receptores o de procesos biológicos que permiten abordar una solución a nivel molecular. Los avances recientes en biología computacional nos dan la oportunidad de identificar moduladores con características mejoradas de potencia, especificidad y traslación clínica. El creciente aumento de estructuras atómicas de proteínas con ligandos unidos o de receptores en estados abierto y cerrado ofrecen una oportunidad excelente para el diseño in silico de terapias útiles para combatir los problemas asociados a las enfermedades de la piel o el envejecimiento. Se comentan las técnicas computacionales basadas en estructura más utilizadas para el descubrimiento de compuestos activos. Seguidamente, de entre todos los problemas que pueden afectar a la piel, nos centraremos en algunos en los que están implicados los receptores sensoriales como TRPV1 (prurito) o los receptores de acetilcolina (hiperhidrosis y envejecimiento) y cómo se puede abordar su estudio a nivel computacional.

 

HERRAMIENTAS COMPUTACIONALES BASADAS EN ESTRUCTURA

Existen una amplia variedad de métodos y bases de datos desarrolladas para el descubrimiento de fármacos capaces de regular los procesos biológicos implicados en las alteraciones cutáneas. El conocimiento de las estructuras tridimensionales de las proteínas implicadas es esencial para comprender cómo funcionan y establecer las necesarias relaciones estructura-función. Tradicionalmente la cristalografía de rayos X ha sido utilizada para determinar la estructura de las proteínas, siendo la técnica mayoritaria en las bases de datos estructurales. Sin embargo, tiene una limitación importante, pues es necesario encontrar las condiciones para producir cristales que difracten adecuadamente. En la última década ha cobrado una gran relevancia la criomicroscopía electrónica, que ha protagonizado una revolución en lo que se refiere a la determinación de estructuras de grandes complejos proteicos, incluyendo proteínas de membrana, a alta resolución.

 

Además de los progresos en la biología estructural, las estrategias computacionales han avanzado gracias al desarrollo de nuevos procesadores cada vez más rápidos, de algoritmos cada vez más refinados y de librerías in silico de compuestos cada vez más variadas. La estrategia computacional tiene las ventajas de bajo costo, rapidez, escalabilidad y automatización. El modelado molecular complementa a las técnicas experimentales y ayuda a generar modelos estructurales de proteínas de estructura desconocida. Toda esta información es esencial en el descubrimiento de fármacos, por lo que los métodos computacionales representan un medio poderoso para impulsar la identificación de nuevos compuestos con capacidad terapéutica.

 

Las herramientas basadas en estructura más utilizadas son el modelado por homología, el diseño racional basado en estructura, el acoplamiento y cribado virtual y la dinámica molecular.

 

El modelado por homología se basa en la premisa de que la estructura está mejor conservada que la secuencia aminoacídica, y aprovecha la cercanía evolutiva de las proteínas para generar modelos tridimensionales de proteínas de estructura desconocida a partir de estructuras conocidas. Básicamente, el modelado por homología compara la secuencia de la proteína diana con la secuencia de las proteínas de estructura conocida, y selecciona un molde sobre el que construir el modelo 3D. De esta forma se transfieren las coordenadas cartesianas del esqueleto peptídico del molde, y se sustituyen con las cadenas laterales de la secuencia diana. En el caso de las proteínas de membrana, se incluye una membrana lipídica y moléculas de agua para asegurar una simulación fisiológica lo más precisa posible.

 

Una vez que tenemos un modelo necesitamos conocer los sitios de unión, para lo que se han desarrollado una amplia variedad de métodos que se basan en la identidad de secuencia, o en la existencia de motivos estructurales del bolsillo de unión. No obstante, la mejor opción para descubrir y diseñar ligandos peptídicos que se unan con una alta probabilidad al sitio de unión es conocer la estructura del sitio de unión a nivel atómico, como es el caso de las proteínas cuya estructura ha sido determinada a alta resolución interaccionando con sus dianas proteicas.

 

 

El diseño racional computacional de péptidos basado en estructura consiste en localizar la estructura tridimensional de la proteína de interés en complejo con la proteína de interacción. Las bases de datos de estructura nos indican si la proteína está disponible para nuestro sistema de estudio, y en caso contrario nos da información acerca de proteínas homólogas de estructura conocida para hacer modelado por homología. La metodología utilizada para la optimización de la secuencia peptídica consiste en someter a la estructura tridimensional proteína-ligando a una serie de etapas que permitan predecir qué aminoácidos se unen mejor en cada una de las posiciones del péptido (Figura 1). Brevemente, se conserva la conformación del esqueleto peptídico, todas las cadenas laterales del péptido se mutan a alanina, y seguidamente cada posición del péptido se explora de forma individual mediante mutagénesis computacional a los 20 aminoácidos naturales. El resto de posiciones del péptido permanece como alanina. Los residuos vecinos del complejo que experimentan choques con las nuevas mutaciones son elajados, cambiando su conformación para acomodar el nuevo entorno tras la mutación. Las estructuras resultantes se evalúan en términos de energía teórica de interacción proteína-péptido, cuantificando de esta forma la habilidad de cada aminoácido de incrementar la interacción proteína-péptido en una posición dada. Estos datos se tabulan en las denominadas matrices de puntuación o de unión proteína-péptido, y pueden ser normalizados según las necesidades (Figura 1). Esta metodología fue desarrollada originalmente para predecir interacciones en dominios SH3, si bien en la actualidad es de uso general para cualquier pareja péptido-proteína. Se utiliza para ello el programa FoldX, un algoritmo de diseño y evaluación de energía desarrollado en el laboratorio de Luis Serrano, y que ha mostrado una gran fiabilidad y precisión.

 

A partir de las matrices de puntuación se pueden derivar secuencias peptídicas hipotéticas mediante combinación de los mejores aminoácidos en cada una de las posiciones del péptido. La energía del péptido puede ser calculada mediante la suma de energías de las posiciones individuales en la matriz de puntuación. Estas secuencias peptídicas se pueden volver a modelar en el entorno tridimensional, teniendo en cuenta esta vez todas las posiciones del péptido simultáneamente, lo que incrementa la fiabilidad de los modelos. Estas predicciones proporcionan listas de péptidos, ordenadas por energía de interacción, que pueden interferir en las interacciones naturales proteína-proteína y pueden ser comprobadas de forma experimental en el laboratorio.

 

El acoplamiento virtual (“docking”) tiene la capacidad de poner en contacto un ligando y un sitio de unión proteico a partir de sus estructuras tridimensionales. El ligando puede ser una molécula orgánica, un péptido o una proteína. La estrategia se basa en la búsqueda conformacional del ligando que mejor se acople al receptor, siendo uno de los factores más importantes la flexibilidad de las moléculas implicadas, y a la vez uno de los mayores retos. El acoplamiento local busca la mejor conformación del ligando flexible en un sitio de unión previamente definido por el usuario. El receptor permanece rígido, ya que no se puede contemplar la flexibilidad completa de la proteína, aunque una mejora habitual es permitir que solo unos pocos residuos del centro activo de la proteína sean flexibles. En el caso de que el ligando sea una proteína, el acoplamiento sólo se puede llevar a cabo con la aproximación del cuerpo rígido, donde se considera que las dos proteínas que interaccionan son completamente rígidas y se evalúa la complementariedad química y geométrica.

 

Se han hecho grandes esfuerzos para mejorar la eficacia y precisión de los algoritmos de acoplamiento, pues representan un método de alto interés para los programas de descubrimiento de fármacos.

 

El cribado virtual acopla, evalúa y puntúa una librería de moléculas orgánicas que se unen a la diana proteica. Se obtiene una lista de moléculas ordenadas en términos de energía y que pueden ser chequeadas experimentalmente. Típicamente, el método aplica la flexibilidad completa del ligando en un sitio de unión con actividad biológica y permite una flexibilidad muy limitada en el receptor. Este método fue adoptado de forma inmediata en la industria para el descubrimiento de fármacos, si bien la técnica tiene dos grandes retos: determinar la conformación correcta del ligando y evaluar la energía de unión.

 

La dinámica molecular se basa en las ecuaciones de movimiento de Newton y hace un estimado de todas las posiciones y los momentos de los átomos del sistema en función del tiempo. La energía potencial del sistema se utiliza para derivar la fuerza que actúa sobre cada átomo a intervalos discretos de tiempo, lo que resulta en la predicción de la evolución temporal del sistema en forma de una trayectoria. La dinámica molecular es especialmente interesante puesto que da información cinética y termodinámica de la interacción ligando-proteína considerando el entorno proteico, incluyendo a la bicapa lipídica, el agua, los iones, diferentes efectores, etc. En la actualidad hay disponibles una gran variedad de campos de fuerza y de algoritmos de dinámica molecular que habitualmente necesitan una potencia de cálculo muy elevada.

 

APLICACIONES DE LAS HERRAMIENTAS COMPUTACIONALES EN LA BIOLOGÍA EPITELIAL

Los métodos computacionales se pueden utilizar para encontrar moléculas activas que sirvan para el tratamiento de diversas afecciones de la piel si se definen claramente las dianas sobre las que actuar.

 

El prurito es una modalidad sensorial muy molesta para humanos y animales que puede durar unos pocos días o puede cronificarse, con la consiguiente molestia para quien la padece. Produce una sensación desquiciante que se calma mediante el rascado de la zona afectada, pudiendo llegar a causar heridas. El mecanismo molecular causante del prurito es multifactorial y complejo, implicando componentes periféricos y centrales. El prurito está en parte producido por una subpoblación de nociceptores entre los que se encuentra el termorreceptor TRPV1 (receptor de capsaicina), perteneciente a la familia de los receptores sensoriales TRP. Desde muy pronto se consideró a TRPV1 como diana terapéutica para el tratamiento del dolor y el prurito crónico, lo que impulsó a grupos de investigación y farmacéuticas al descubrimiento y desarrollo de antagonistas lo más potentes y selectivos posible. Sin embargo, los estudios clínicos de algunos de estos compuestos se frustraron bruscamente al descubrir que producían hipertermia, pues inhibían de manera indiscriminada a TRPV1 en todos los tejidos y modos de activación. Una alternativa es el uso de compuestos hidrolizables por las esterasas de la dermis y cuyos productos sean fácilmente metabolizables. Es el caso del desarrollo del compuesto AG1529 (2-((4-hidroxi2-yodo-5-metoxibenzil)amino)-2-oxoetil dodecanoato), aislado a partir de una quimioteca obtenida por modificación química de la capsaicina, que se comportó como un antagonista potente de TRPV1, con una IC50 de 0.9±0.5 µM, y una eficacia de inhibición de alrededor del 80% del receptor humano. El hecho de que este tipo de compuestos se una al mismo sitio de unión que la capsaicina, junto con la determinación de la estructura del receptor TRPV1 mediante crio-microscopía electrónica de alta resolución, abrió la puerta a la utilización de las técnicas computacionales de acoplamiento, cribado virtual y dinámica molecular para la búsqueda in silico de antagonistas con propiedades mejoradas de afinidad y especificidad. Son numerosos los trabajos de investigación que describen el cribado virtual de TRPV1 utilizando librerías focalizadas de compuestos con el objetivo de descubrir antagonistas de TRPV1 que nos permitan entender el papel crítico de este receptor en el tratamiento del dolor crónico y en nuevas áreas terapéuticas.

 

 

La hiperhidrosis es una afección que presenta una sudoración excesiva en las personas que la padecen, y en las que las glándulas sudoríparas tienen una actividad aumentada. Estas glándulas están reguladas por el neurotransmisor ACh que actúa sobre dos tipos de receptores de acetilcolina, los muscarínicos y los nicotínicos en las sinapsis neuronales colinérgicas (Figura 2). Se ha comprobado que la producción de sudor está controlada parcialmente por los receptores muscarínicos y que la administración de antagonistas del receptor muscarínico atenúa o impide la sudoración, lo que muestra la implicación de este proceso en la transpiración.

 

Teniendo en cuenta el esquema mostrado en la Figura 2, se puede plantear el diseño y evaluación de moléculas que impidan la sudoración por partida doble, bien mediante la regulación de la exocitosis vesicular del neurotransmisor, o bien mediante el descubrimiento de antagonistas de los receptores muscarínicos.

 

 

Regulación de la exocitosis vesicular. El proceso de fusión vesicular implica una cascada de procesos exquisitamente regulados por un conjunto de proteínas que interaccionan entre sí y que culminan en la fusión de las vesículas cargadas de neurotransmisor en la membrana. Este proceso complejo está mediado por las proteínas SNARE, que incluyen la proteína asociada a membrana Sintaxina1, la proteína asociada a sinaptosomas SNAP25, y la proteína asociada a vesículas VAMP. Estas proteínas orquestan la unión de la vesícula a la membrana y su fusión mediante la formación de una estructura en superhélice denominada complejo SNARE, que representa la maquinaria mínima necesaria para la fusión (ver detalles en Figura 3). La formación del complejo SNARE neuronal ancla las vesículas a la membrana presináptica y las deja en un estado competente para la fusión. Este proceso viene mediado por otras proteínas que se asocian al complejo y forman la maquinaria exocítica completa. En las etapas previas, Munc18 permanece unida a Sintaxina1 y al resto del complejo SNARE, protegiéndolo de la proteína NSF-SNAPs y evitando su separación (Figura 3A). El complejo SNARE entonces tiraría de las dos membranas y las posicionaría para ayudarlas a iniciar la fusión. Consecuentemente, la identifi cación y validación de moléculas capaces de romper la interacción Munc18-Sintaxina1 podría constituir un modo de inhibición de la exocitosis vesicular.

 

Existe una estructura cristalina de la proteína Munc18 en complejo con Sintaxina1 (código PDB: 3C98), por lo que se han podido diseñar péptidos capaces unirse a Munc18 e interferir en la interacción con Sintaxina1, impidiendo la liberación del neurotransmisor. Se derivaron péptidos utilizando el método del diseño racional computacional basado en estructura comentado anteriormente, siendo el péptido LMUNCL correspondiente al fragmento 42-SSCCKMTDIMT-52 de Munc18, el que dio los mejores resultados. La actividad biológica del péptido se probó cuantifi cando la liberación del neuropéptido CGRP tras señalización extracelular en neuronas sensoriales, así como cuantifi cando la liberación de ACh en la línea celular de neuroblastoma SHSY5Y.

 

Regulación del receptor muscarínico excitatorio M3. Los receptores muscarínicos comprenden una familia de 5 miembros de receptores acoplados a proteína G y se dividen en inhibitorios (M2 y M4) y excitatorios (M1, M3 y M5), expresándose en todos los tipos celulares de la piel, incluidas las glándulas sudoríparas. De entre todos los receptores, se considera al M3 el principal responsable de la generación del sudor y el que mayores niveles de expresión presenta en la piel de las palmas de las manos y en las plantas de los pies. La inhibición del receptor M3 se puede abordar mediante el diseño de péptidos dirigidos a sitios de unión alostéricos, concretamente en la región citosólica del M3 encargada de unirse a la proteína G, subunidad alfa excitatoria (Gq/11), y de esta forma impedir la activación. Estos péptidos mostraron su potencial utilidad en el tratamiento y/o cuidado de afecciones, trastornos y/o enfermedades de la piel, por lo que han sido objeto de una patente que identifica péptidos concretos de entre 4 y 15 aminoácidos (p.e. WMRL o KMTMRMLYFKYMMWW) que inhiben la actividad de M3 y paralizan la cascada de señalización.

 

Siguiendo la misma línea argumental mostrada para la hiperhidrosis, se puede abordar el envejecimiento de la piel, un proceso biológico complejo que implica multitud de factores intrínsecos y extrínsecos. Uno de los signos más llamativos del envejecimiento cutáneo es la aparición de arrugas, que se manifiestan de forma natural con el paso del tiempo (arrugas finas, rugosidad superficial, sequedad y debilidad de la piel) y se correlacionan con cambios bioquímicos, histológicos y fisiológicos (factores genéticos, hormonales y metabólicos), que se ven reforzados por la exposición al medio ambiente. La formación de arrugas faciales aparece por la estimulación excesiva de las fibras musculares, que tensan la piel hacia adentro y da lugar a las denominadas arrugas de expresión.

 

Un planteamiento útil para reducir la intensidad de las arrugas de expresión es la regulación negativa de la actividad muscular, ya sea directamente en la célula muscular o atenuando la actividad del nervio. En la unión neuromuscular (Figura 2B), el neurotransmisor se libera y activa al receptor de ACh en la membrana postsináptica muscular, dando lugar en última instancia a la contracción muscular. Nuevamente, se puede regular la liberación de neurotransmisor al espacio sináptico, o bien se puede regular el agrupamiento de los receptores en la membrana. A partir del N-terminal de una de las proteínas del complejo SNARE, SNAP25, se derivó un péptido (Ac-EEMQRR-NH2) que interfiere con el ensamblaje del complejo SNARE y con la liberación de las vesículas de neurotransmisor (Figura 3B y C). El péptido mostró una buena permeación a través de la piel, no mostró toxicidad ni irritabilidad significativas y su uso tópico redujo la intensidad de las arrugas en ensayos con voluntarios. Este péptido fue nombrado y registrado como Argirelina® y está en explotación desde el año 2001.

 

También es posible la regulación del agrupamiento de receptores en la membrana postsináptica, que viene determinada por tres proteínas clave denominadas MuSK, Rapsina y Agrina (Figura 2B). Una alteración en alguna de estas proteínas supone una alteración del agrupamiento del receptor de ACh, resultando en una disminución de la actividad de la unión neuromuscular. Así pues, utilizando la proteína quinasa MuSK, es posible usar una aproximación racional computacional basada en estructura para derivar péptidos pequeños que se unan al sitio activo de MuSK y compitan por su ligando natural. De esta forma se pudo modular la actividad quinasa de MuSK inducida por Agrina, disminuyendo el agrupamiento de receptores, reduciendo la actividad muscular y como consecuencia reduciendo la formación de arrugas en la piel.

 

 

CONCLUSIONES

El empleo de herramientas computacionales puede acelerar el descubrimiento de compuestos que modulen la actividad de receptores, o que interfieran con las interacciones proteína-proteína implicados en las patologías cutáneas de interés. El uso combinado de estas técnicas computacionales nos da una visión de las interacciones atómicas entre ligandos y receptores y nos permite el desarrollo de compuestos específicos dirigidos a interferir en los procesos biológicos. Las técnicas de acoplamiento y cribado virtual proporcionan herramientas muy valiosas tanto para el descubrimiento de nuevos fármacos, como para el reposicionamiento de los mismos o el estudio de las interacciones proteína-proteína. La técnica de aproximación racional basada en la estructura tridimensional de las proteínas ha mostrado su capacidad para predecir o descartar péptidos susceptibles de tener un efecto biológico en el sistema de estudio. El uso de péptidos dirigidos contra interacciones proteína-proteína es conveniente puesto que los péptidos utilizados como fármacos suelen ser más selectivos, si bien suelen tener peor biodisponibilidad oral. Los péptidos presentan una elevada potencia y eficacia de acción, pueden tener un alto grado de penetración celular, suelen ser poco tóxicos y solubles en agua. Hay muchos ejemplos de péptidos que interfieren en las interacciones proteína-proteína y que son utilizados para el tratamiento de diversas enfermedades (http://www.clinicaltrials.gov/).

 

A pesar de los recientes avances en las técnicas computacionales para el estudio de la interacción ligando-receptor, hay desafíos que deben ser afrontados. Los algoritmos de acoplamiento y de dinámica molecular deben ser deben mejorados para explorar, refinar y optimizar las propiedades de unión entre ligandos y receptores. La mejora de la potencia de cálculo, es decir, la habilidad de procesar datos y realizar cálculos complejos a alta velocidad, es de importancia capital para poder llevar, por ejemplo, los cálculos de dinámica molecular a escalas de tiempo de milisegundos.

 

En la actualidad, el conocimiento acumulado en las bases de datos estructurales y de interacciones proteína-proteína se está utilizando con métodos de aprendizaje automático para proceder al entrenamiento de los algoritmos de predicción. Se utilizan métodos con base estadística para determinar la propensión de unión de ciertos aminoácidos a su diana, así como métodos de aprendizaje automático para hacer lo mismo utilizando información estructural. Esta metodología aumenta el poder de predicción de las crecientes bases de datos y se usa para diseñar nuevas moléculas con las propiedades deseadas, con selectividad aumentada y con la seguridad requerida. Se espera que, en el futuro cercano, la inteligencia artificial participará en todas las etapas del descubrimiento de fármacos, integrando las plataformas de acoplamiento, dinámica molecular, predicción de propiedades físicoquímicas, etcétera, a partir de datos genómicos, proteómicos, interatómicos y biomédicos.

 

PARA LEER MÁS

Blanes-Mira C, et al. (2002). A synthetic hexapeptide (Argireline) with antiwrinkle activity. International Journal of Cosmetic Science, 2002, 24, 303-10

Fernández-Ballester G, et al. (2020). Targeting thermoTRP ion channels: in silico preclinical approaches and opportunities, Expert Opinion on Therapeutic Targets, doi: 10.1080/14728222.2020.1820987

Fernández-Ballester G, et al. (2009). Structure-Based Prediction of the Saccharomyces cerevisiae SH3–Ligand Interactions. J. Mol. Biol. 388, 902–16. doi:10.1016/j.jmb.2009.03.038

Lee CM (2016). Fifty years of research and development of cosmeceuticals: a contemporary review. J Cosmet Dermatol. 15(4):527-39. doi: 10.1111/jocd.12261.

Nikolaeva-Koleva M, Fernández-Ballester G, (2019). In silico approaches for TRP channel modulation. In: Ferrer-Montiel A, Hucho T, editors. TRP channels. Methods in molecular biology. Vol. 1987. Springer, p. 187–206.

Rizo J, Südhof TC (2012). The membrane fusion enigma: SNAREs, Sec1/Munc18 proteins, and their accomplices--guilty as charged? Annu Rev Cell Dev Biol. 28:279-308. doi: 10.1146/annurev-cellbio-101011-155818.

Serafini M, et al. Targeting transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) channel softly: the discovery of Passerini adducts as a topical treatment of inflammatory skin disorders. J. Med Chem, 2018; 61: 4436-55.

 


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