Viroides: los parásitos extremos (Especial XXXVIII Congreso SEBBM)

Artículo publicado en septiembre de 2015

Especial XXXVIII Congreso SEBBM

DOI: http://dx.doi.org/10.18567/sebbmdiv_ANC.2015.09.1

Ricardo Flores Pedauyé 

Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (IPV-CSIC)
rfloresemailibmcp.upv.es

 

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Los viroides son pequeños RNA circulares (250-400 nucleótidos), que aun sin codificar proteína alguna, infectan e inducen enfermedades en plantas. Algunos muestran actividad catalítica, es decir, "codifican" ribozimas que median su replicación. Esta propiedad, junto con su simplicidad estructural, conduce a considerarlos fósiles moleculares del «Mundo de RNA» que se presume antecedió al nuestro basado en el DNA y las proteínas. Patógenos de esta clase no se han descrito en animales, aunque el RNA del virus de la hepatitis delta humana muestra notables paralelismos con los viroides.

Sin entrar a definir qué es la vida, cuestión sobre la que se ha discutido profusamente, todos los seres vivos comparten una propiedad característica: generan copias de sí mismos en un entorno adecuado, es decir, tienen multiplicación o replicación autónoma.
Fijado este marco los viroides se sitúan en la frontera inferior de la vida, aspecto que inmediatamente atrae la atención sobre ellos ya que nos sentimos particularmente fascinados por los extremos de las escalas (moviéndonos en la dirección opuesta, pensemos en los dinosaurios). El paradigma que consideraba a los virus como el peldaño inferior de la escala biológica permaneció inmutable durante los primeros 70 años del siglo pasado, asumiéndose de manera implícita que todos los patógenos acelulares eran virus. Este largo período se interrumpió al descubrirse que la enfermedad del tubérculo fusiforme de la patata estaba causada por un agente mucho más simple al que se denominó viroide, potato spindle tuber viroid (PSTVd) en este caso.
Para una mejor comprensión del resto del artículo digamos que los viroides son RNAs circulares de tan sólo 250-400 nt, un tamaño significativamente inferior al del genoma de los virus más pequeños, que infectan y causan síntomas en plantas económicamente importantes, aunque también hay viroides (y virus) asintomáticos (1, 2).
Estas propiedades estructurales tan peculiares, ¿conllevan implicaciones funcionales también singulares? Sí. Los viroides no codifican proteínas propias, mientras que todos los virus codifican una y frecuentemente varias. Simplificadamente podríamos decir que mientras los virus son parásitos de la maquinaria de traducción de sus huéspedes, los viroides lo son de la de transcripción, pues deben secuestrar RNA polimerasas (y otros factores celulares preexistentes) y reprogramarlos para que medien su replicación e invasión sistémica del huésped. La presencia de una región central conservada en la mayoría de los aproximadamente 30 viroides conocidos, junto con su replicación nuclear,permite agruparlos en una primera familia Pospiviroidae(miembro tipo PSTVd). Esta región, sin embargo, no existe en cuatro viroides agrupados en la familia Avsunviroidae, que se replican en cloroplastos y presentan una extraordinaria propiedad: sus cadenas de ambas polaridades están dotadas de actividad catalítica (contienen ribozimas, ver más adelante).
¿Cómo transcurre la replicación de los viroides? Tras entrar en la célula huésped el RNA viroidal infeccioso, al que arbitrariamente se asigna la polaridad (+), secuestra una RNA polimerasa que transcribe reiteradamente el molde circular (+) generando multímeros de polaridad (-) formados por varias unidades en tándem que pueden: i) servir a su vez como molde para la síntesis de RNA multiméricos (+) que luego se cortan a longitud unitaria mediante una ribonucleasa (RNasa) y se circularizan por una RNA ligasa, generando así moléculas idénticas a las de partida; o ii) ser procesados a longitud unitaria y subsiguientemente circularizados a monómeros (-), que sirven de molde para la síntesis de RNAs multiméricos (+) que siguen la ruta anterior. En cualquiera de las dos vías de este mecanismo, denominado de círculo rodante, se requieren tres actividades enzimáticas: RNA polimerasa, RNasa y RNA ligasa.
Respecto a la primera, las RNA polimerasas implicadas, que en condiciones normales transcriben moldes de DNA, son forzadas por los viroides (de manera que aún ignoramos) a que acepten moldes de RNA. El corte de los intermediarios multiméricos a RNAs de longitud unitaria es catalizado en la familia Pospiviroidae por una RNasa(s) de la clase III, mientras que en la familia Avsunviroidae dicha función está sorprendentemente mediada por ribozimas incrustadas en los RNAs viroidales de ambas polaridades, sobre los que actúan en cis. Estas ribozimas, llamadas de cabeza de martillo, son las más sencillas y mejor estudiadas, y su descubrimiento tiene hondas implicaciones evolutivas para los viroides. No extrañará si digo que la tercera etapa del ciclo replicativo también ha deparado su sorpresa: mientras que en la familia Avsunviroidae es una tRNA ligasa convencional translocada al cloroplasto, en la Pospiviroidae es una DNA ligasa nuclear forzada a aceptar sustratos de RNA, una muestra más de las extraordinarias habilidades mecanísticas que despliegan los viroides.
¿Cómo causan enfermedad los viroides? Durante tiempo se pensó que por alteraciones en la homeostasis del huésped derivadas del secuestro de factores del mismo necesarios para completar su ciclo infeccioso. Sin embargo, más recientemente ha surgido la hipótesis (con soporte experimental en un caso) de que ciertos pequeños RNA viroidales (21-24 nt) generados por proteínas Dicerlike (la primera barrera del silenciamiento mediado por RNA) se unen a proteínas Argonauta (la segunda barrera del silenciamiento mediado por RNA) y las dirigen a cortar mRNAs específicos del huésped y en última instancia a los síntomas. Éstos podrían ser una consecuencia fortuita o, alternativamente, un "efecto buscado" por los viroides para incrementar su supervivencia (como algunos datos apuntan).
A la vista de unas propiedades estructurales y funcionales tan distintas entre virus y viroides, ¿tienen los segundos, en contra de lo que su nombre parece sugerir, un origen evolutivo independiente de los primeros? Muy probablemente sí. Los viroides muestran propiedades que los hacen excelentes candidatos a ser supervivientes del «Mundo de RNA»: pequeño genoma (para impedir la catástrofe de error causada por una replicación poco fiel), alto contenido G+C (para incrementar dicha fiabilidad), genoma circular (para impedir pérdidas de información en los extremos), y sin capacidad codificante y con actividad catalítica, la huella dactilar del "Mundo de RNA" (3, 4). Lo que empezó como la búsqueda del presumible virus causante de una enfermedad de plantas nos ha proporcionado perspectivas sobre las primeras etapas evolutivas de la vida ilustrando, una vez más, que la ciencia fluye por rutas plagadas de sorpresas (que son las que hacen tan apasionante su práctica).

Figura. Micrografía electrónica de una mezcla de
preparaciones purificadas del PSTVd RNA y el DNA viral del
fago T7. Las diferencias de tamaño y la estructura en varilla
del viroide quedan claramente ilustradas. (Reproducida con
permiso de Diener, "Viroids and Viroid Diseases", Wiley,
1979).

REFERENCIAS

1. Diener, T.O. 2003. Discovering viroids: a personal perspective. Nat. Rev. Microbiol. 1, 75-80.
2. Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A.E., Daròs, J.A., Di Serio, F. 2005. Viroids and viroid-host interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 117-139.
3. Diener, T.O. 1989. Circular RNAs: relics of precellular evolution? Proc. Natl Acad. Sci. USA 86, 9370-9374.
4. Flores, R., Gago-Zachert, S., Serra, P., Sanjuán, R., Elena, S.F. 2014. Viroids, survivors from the RNA world? Annu. Rev. Microbiol. 68, 395-414.

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Entrevista

Ricardo Flores Pedauyé 
Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (IPV-CSIC)

rfloresemailibmcp.upv.es

P.- ¿Le influyó alguien de forma especial? ¿Recibió de joven algún consejo al cuál siga siendo fiel?

R.- Me influyeron varios mentores, unos más próximos (V. Conejero) y otros más a distancia, unos nacionales y otros foráneos (J.S. Semancik). De alguien de ellos aprendí que una vez seleccionado un tema de investigación era necesario abordarlo en su conjunto y no desde la perspectiva particular en la que uno es especialista. Y como corolario de lo anterior, que era aconsejable colaborar con investigadores de un perfil complementario al propio más que con aquellos que se mueven en nuestras mismas coordenadas. Esta recomendación me ha sido muy útil a lo largo de mi carrera profesional y me permito brindársela a quienes se encuentran en etapas iniciales de la suya.
Otro consejo que me gustaría transmitir a jóvenes investigadores es la necesidad de adquirir una buena formación básica en su disciplina, tratando de entender el fundamento de lo que hacen cada día en el laboratorio y no siguiendo meramente las instrucciones de un estuche de reactivos (alguien ha dicho muy acertadamente que la actual es la generación-kit). Sin entender los fundamentos, aún teniendo una buena idea, no pueden introducirse los cambios necesarios para verificarla (o refutarla).
No hay dos sin tres. Mi tercer consejo lo tomo de N. Cozzarelli, que recomendaba a un científico en ciernes desarrollar sus habilidades comunicativas: "Si usted tiene éxito en ciencia, una parte muy importante de su tiempo la empleará escribiendo, leyendo, hablando, escuchando". Un artículo científico pertenece al género ensayo, y quien no lee ensayos en su propio idioma no puede pretender escribirlos en otro foráneo (inglés). La escritura de un artículo es la culminación de un trabajo experimental (y el único registro que finalmente queda del mismo), por lo que es crucial prestarle la debida atención y esfuerzo, y obtener el correspondiente goce como compensación (aunque en este último punto no coincidan algunos, que abordan la escritura como un auténtico suplicio). Dos citas a este respecto. La primera demanda claridad y fluidez: "No hay forma prosa más difícil de entender ni más tediosa de leer que la de un típico artículo científico" (F. Crick). La segunda además de claridad reclama honestidad y, por cierto, de una forma muy contundente: "Tras un párrafo opaco siempre se oculta un ignorante o un delincuente" (P. Medawar).

P.- ¿Podría resumirnos brevemente su trayectoria profesional?

R.- Escoger una línea de investigación es posiblemente la decisión más difícil de una carrera científica, que además se toma cuando aún se carece de madurez adecuada. Afortunadamente la mayoría de las líneas, abordadas con empeño y dedicación, proporcionan gratificaciones intelectuales más que suficientes. Yo creo que tuve particular suerte en mi elección inicial. Cuando terminé mi tesis doctoral sobre la purificación y caracterización de un virus de plantas, decidí hacer el posdoctorado en la Universidad de California, Riverside (con J.S. Semancik), sobre un tema entonces emergente, los viroides, a quienes me he mantenido "fiel" el resto de mi carrera. Aparte de su interés inicial como causantes de enfermedades en plantas, los viroides tienen propiedades únicas que los hacen extremadamente atractivos desde el punto de vista de la biología molecular del RNA y del origen de la vida en la Tierra (ver más abajo, así como el artículo de divulgación que acompaña a esta entrevista).

P.- ¿Cuáles son desde su punto de vista las características que definen a un buen investigador?

R.- No tengo dudas al respecto: pasión y tenacidad. Ninguna labor creativa de cierto valor (ni en ciencia ni en arte) puede llevarse a cabo sin ellas. Con respecto a la primera, S. Ramón y Cajal dijo: "En la ciencia, como en la vida, el fruto viene siempre después del amor" (que me atrevo a apostillar, tiene un fuerte ingrediente de pasión). En este mismo contexto Darwin (creo que en su autobiografía) escribió que no se consideraba más dotado intelectualmente que la mayoría de sus colegas, pero que sí que sentía una particular pasión por su trabajo. Por otra parte, la tenacidad es necesaria para seguir investigando cuando las cosas no están claras. Un conocido virólogo (V. Racaniello) ha hecho propia una máxima de San Francisco, que la transcribo en su versión original italiana: "Tanto sa ciascuno quanto opera". A propósito, la fase de la investigación en que "las cosas no están claras" debe saborearse porque es quizás la más apasionante: esa etapa cuando se vislumbra la solución pero aún no se tiene la respuesta "definitiva" (que en ciencia no es tal sino, como bien sabemos, provisional y temporal; si algo enseña nuestra profesión es humildad). Una vez se alcanza dicha respuesta desaparece el hechizo y hay que buscar una nueva pregunta para reiniciar el ciclo. Todo esto no excluye disfrutar del hallazgo final: "No hay nada como el momento del eureka, de descubrir algo que nadie sabía antes; no lo compararé con el sexo, pero dura más" (S. Hawking).
En mi opinión un buen científico debe disfrutar del "día a día" de su laboratorio como el simple revelado de un gel que muestra unas bandas de proteínas o de productos de PCR bien resueltas y definidas. Si no se disfrutan los pequeños resultados diarios se pierde uno de los mayores placeres que proporciona esta profesión, lo que muy expresivamente se denomina en inglés to have fun.

P.- ¿Podría describirnos brevemente en qué consiste su línea de investigación actual y cuál es su trascendencia?

R.- El trabajo de mi laboratorio se ha centrado en la estructura, función y evolución de los viroides, que a pesar de su nombre, difieren en estos tres aspectos de los virus. Los viroides son el peldaño inferior de la escala biológica: pequeños RNA circulares de tan solo 250-400 nucleótidos, que aún careciendo de capacidad codificante (todos los virus dirigen la síntesis de una o más proteínas propias), infectan ciertas plantas. Además, algunos de estos RNAs muestran actividad catalítica, es decir, se pliegan (de manera similar a como las proteínas enzimáticas adoptan su estructura tridimensional catalíticamente activa) formando ribozimas que median su replicación. Esta propiedad de los viroides, junto a su simplicidad estructural y falta de capacidad codificante, ha conducido a considerarlos fósiles moleculares del «Mundo de RNA» que se presume precedió a nuestro mundo actual basado en el DNA y las proteínas.
Como puede intuirse, los viroides permiten adentrarse en varios campos de la Biología Molecular, y muy en particular, en el que se centra sobre el RNA, esa macromolécula que del modesto papel que inicialmente se le asignó de mero transmisor de la información genética entre el todopoderoso DNA (the almighty DNA, como muy acertadamente alguien lo ha calificado) y las versátiles proteínas, ha pasado a ocupar un papel regulador central en la expresión de dicha información. Por razones técnicas una parte muy importante de los estudios moleculares sobre el RNA se ha hecho (y aún se hace) con RNA renaturalizado después de un tratamiento térmico. Sin embargo, en la mayoría de los casos no sabemos si el RNA se renaturaliza adoptando una única conformación ni si esa conformación es la biológicamente relevante. Los plegamientos no nativos del RNA son frecuentemente muy estables y suponen una seria barrera cinética para muchos RNAs que han sido desnaturalizados. Incluso los transcritos in vitro no desnaturalizados, que se emplean con mucha frecuencia porque son fáciles de preparar, pueden no adoptar la conformación fisiológica. Todo esto sin contar que ciertos RNAs necesitan unirse a proteínas para mantener su conformación activa, que puede alterarse al eliminar dichas proteínas. Así pues son necesarias pruebas genéticas o filogenéticas que complementen los datos bioquímicos. Los RNAs viroidales, con una gran cantidad de información genética compactada en un pequeño tamaño, son sistemas modelos muy apropiados en este contexto. Es importante tener además en cuenta que la estructura del RNA no sólo está mantenida por interacciones canónicas (pares Watson-Crick) sino por muchas otras no canónicas.
Adicionalmente a su interés académico, los viroides causan enfermedades en plantas de gran importancia económica (patata, tomate, cítricos, etc.), por lo que su estudio también tiene una vertiente aplicada. Descubrir un nuevo patógeno, un viroide en este caso, y confirmar para el mismo los postulados de Koch tiene un encanto especial, que se incrementa aún más si uno lo desentraña (lo secuencia) y lo bautiza, con lo que en cierto modo pasa a ser "suyo". A propósito, de forma paralela a como el primer ejemplo de virus -el causante del mosaico del tabaco- se describió en el mundo de las plantas (encontrándose posteriormente virus que infectan todo tipo de células, incluidas las más sencillas, los micoplasmas), el primer ejemplo de patógeno subviral con replicación autónoma -el viroide causante del tubérculo fusiforme de la patata- también se describió asociado al mundo de las plantas, que a lo largo de la historia de la Biología ha sido una fuente de nuevos conceptos (sin ir muy lejos, pensemos en la Genética). Este viroide fue el primer patógeno de eucariotas secuenciado, no vía cDNA sino por secuenciación directa (un auténtico rompecabezas que mereció la portada de Nature en 1978), abriendo en cierto modo la era genómica. No se han descrito por el momento viroides en animales (quién sabe si los estudios de metagenómica nos depararán alguna sorpresa), aunque el RNA del virus de la hepatitis delta humana muestra notables paralelismos con los viroides. Los descubridores de este agente, al constatar que sus propiedades tan peculiares no tenían parangón en el mundo animal, tornaron su mirada hacia las plantas y se dieron de bruces con los viroides. A partir de lo que se conocía sobre éstos, conjeturaron que el RNA del virus de la hepatitis humana podría replicarse de forma similar: por un mecanismo de círculo rodante que en algunos de los viroides está mediado por ribozimas. Acertaron de pleno y descubrieron una nueva clase de ribozimas muy importantes en Biotecnología. Otra reiteración de lo que decía más arriba: conceptos nuevos descritos en la Biología Vegetal han precedido e iluminado el camino a la Biología Animal. Sigue siendo importante financiar la investigación en plantas per se, además de por sus potenciales beneficios prácticos. 

P.- ¿Cuál consideraría que ha sido el principal avance científico del siglo XX?

R.- En Biología el descubrimiento del DNA como soporte de la información genética (por el grupo de O. Avery, un científico ejemplar no suficientemente reconocido) y la elucidación de su estructura (por J. Watson, F. Crick, R. Franklin and M. Wilkins). Más recientemente el descubrimiento de los priones (por S. Prusiner) ha proporcionado otra de esas grandes sorpresas que, dicho sea de paso, siempre acompañan a la buena ciencia. En palabras de R. Wickner (que descubrió los priones en levadura): "Así como ciertos RNAs funcionan como enzimas (las ribozimas), ciertas proteínas (los priones) funcionan como genes "codificando" la conversión de la isoforma normal en la patogénica". Puesto de otra manera, los priones "se replican" sin un soporte de ácido nucleico, un concepto aún más rompedor que el de las ribozimas, que arrumbaron el viejo dogma de la Bioquímica: todas las enzimas son proteínas.
Más allá de la Biología, los principales avances científicos del siglo XX han sido la Teoría Cuántica y la Cosmología en Física, y la Tectónica de Placas en Geología. En Química no me atrevo a concretar tanto, pero pensemos por un momento cómo podría alimentarse el mundo sin la fijación del nitrógeno atmosférico mediante la síntesis de Haber-Bosch.
Plinio escribió: "Después de observar la Naturaleza debo reconocer que nada increíble puede pensarse de ella". Es decir, que es capaz de todo, y que recompensa a quien la estudia con continuas nuevas sorpresas. Plinio también dejó escrita otra frase que a mí me gusta particularmente y que he citado en numerosas ocasiones. "En ningún lugar se encuentra la Naturaleza en toda su plenitud como en sus criaturas más pequeñas". Estoy convencido de que al gran naturalista romano le hubiera encantado saber de los viroides. Para redondear su vida de compromiso con la ciencia, Plinio murió víctima de su propia curiosidad observando "en directo" la erupción del Vesubio del 79 D.C. que lo enterró junto a Pompeya y Herculano. La mejor de las muertes imaginables para un científico.

Perfil biográfico

Ricardo Flores Pedauyé
Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (IPV-CSIC)
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Ricardo Flores Pedauyé es desde 1989 Profesor de Investigación del CSIC en el Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (CSIC - Universidad Politécnica de Valencia, UPV). Ingeniero Agrónomo (UPV) y Licenciado y Dr. en Ciencias Químicas (Universidad de Valencia), realizó una estancia posdoctoral (1976-77) en la Universidad de California, Riverside, donde se inició en el estudio de los viroides, sobre cuya replicación, patogénesis y evolución ha versado la mayor parte de su carrera científica.
Estos agentes, pequeños RNAs (250-400 nt) que sin codificar proteína alguna infectan e inducen enfermedades en plantas, son estructural, funcional y evolutivamente independientes de los virus y representan el peldaño inferior de la escala biológica.

Miembro del comité editorial de varias revistas internacionales especializadas en Virología y en RNA, ha formado parte de diversas comisiones nacionales e internacionales de evaluación de la actividad científica. Anterior Vicepresidente de la Sociedad Española de Virología (y receptor de su premio bianual) y Miembro Honorario de la Academia de Ciencias de Hungría.

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