Isothermal titration calorimetry: unraveling biological Interactions

Article published in July 2020

DOI: htttp://dx.doi.org/10.18567/sebbmdiv_ANC.2020.07.1

Adrián Velázquez Campoy

Investigador ARAID, Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Universidad de Zaragoza

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Isothermal titration calorimetry is a versatile biophysical technique that has become the gold-standard for affinity determination. It is employed in basic studies on biological interactions and physiological mechanisms, as well as applied developments for lead compounds validation and optimization in drug discovery.

En los seres vivos tienen lugar continuamente procesos de interacción dependientes de proteínas: enzima-substrato, enzima-inhibidor, receptor-ligando, proteína-proteína, proteína-DNA, etc. Los mecanismos fisiológicos se pueden descomponer en series de procesos elementales de interacción (asociación/disociación) y de cambios conformacionales acoplados, de modo que un mecanismo complejo se puede estudiar mediante la caracterización de esos procesos elementales.

En procesos de interacción reversibles que conducen a la formación de complejos mediante interacciones no covalentes (A+BAB), cuanto más negativo es el incremento de energía de Gibbs en el proceso de asociación, mayor es la fortaleza de la interacción y la tendencia a formar el complejo (mayor constante de asociación –afinidad– y menor constante de disociación), mientras que cuanto menos negativo es dicho incremento, menor es la fortaleza de la interacción y la tendencia a formar el complejo (menor constante de asociación y mayor constante de disociación).

La calorimetría isotérmica de titulación (o valoración) permite determinar la variación de energía de Gibbs estándar asociada a un proceso de interacción, además de la variación de entalpía y la estequiometría de la interacción (1). Por tanto, también permite determinar la constante de equilibrio de interacción y la variación de entropía. Y todo ello en un único ensayo experimental basado en la medida de calor. Este conjunto de parámetros de interacción constituye el perfil termodinámico de la interacción y constituye la base para describir el modo de interacción.

Hoy día el término titulación designa al propio proceso de añadir gradual y progresivamente una disolución de un reactivo sobre otro. En un calorímetro isotérmico de titulación se estudian procesos de interacción mediante la adición controlada de un reactivo A en disolución desde una jeringa de inyección (reactivo titulante) sobre otro reactivo B localizado en una célula termostatizada (reactivo titulado) (ver Figura). La adición de titulante A perturba el estado de equilibrio químico en la célula (exceso de especies químicas libres, reactivos), de modo que el sistema evoluciona (principio de Le Châtelier) minimizando dicha adición y se forma el complejo AB (producto). La concentración de complejo AB formado depende de la concentración total de reactivos A y B, y de la constante de equilibrio de interacción. Además, la formación de complejo AB está acompañada por calor puesto en juego en dicho proceso, que depende de cuánto complejo AB se forma y de la entalpía molar de interacción (formación del complejo). En este tipo de titulación el elemento indicador es el propio calor de reacción. El proceso continúa hasta que se consigue saturar o neutralizar (casi) todo el reactivo B posible y se acumula el complejo AB. Del ensayo se obtiene una isoterma de interacción en la que se representa el calor asociado con cada adición de reactivo A frente al avance del proceso de formación de complejo AB. Mediante un análisis preciso de los datos experimentales, considerando el equilibrio químico y la conservación de masa para cada reactivo, se puede estimar la constante de equilibrio del proceso de interacción, la energía de Gibbs, la entalpía y la entropía de interacción, así como la estequiometría del complejo.

La calorimetría isotérmica de titulación permite estudiar interacciones básicas A+B→AB, para describir el modo de interacción de una proteína con otra biomolécula, entender la especificidad de las interacciones en proteínas, confirmar la interacción de un compuesto candidato a fármaco con su proteína diana, o discriminar la susceptibilidad de ligandos frente a mutaciones o variabilidad en la proteína diana (2,3). Además, realizando titulaciones calorimétricas en diferentes condiciones (ej. temperatura, pH, fuerza iónica, tampón) se consigue obtener información sobre las interacciones interatómicas (interacciones de hidrógeno, electrostáticas, van der Waals e hidrofóbicas) responsables de dicha interacción, y empleando variantes funcionales (mutantes) de la proteína y el ligando es posible identificar grupos funcionales clave para dicha interacción.

También permite abordar interacciones más complejas caracterizadas por fenómenos cooperativos y/o alostéricos reguladores: interacción de una molécula que altera la interacción de otra de diferente o igual naturaleza con la misma macromolécula (interacciones heterotrópicas y homotrópicas) (4,5,6), acoplamiento de interacciones con cambios conformacionales y plegamiento en proteínas (7), e interacción de moléculas pequeñas y proteínas con membranas lipídicas, entre otros casos relevantes.

 

 

 Figura Acercate Julio2020

 

 Figura. Titulación calorimétrica: esquema básico experimental, termograma e isoterma de interacción.

 

References:

1. Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S.A. and Freire, E. (2015) Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry. Methods Mol Biol.1278, 183-204.
2. Claveria-Gimeno, R., Lanuza, P.M., Morales-Chueca, I., Jorge-Torres, O.C., Vega, S., Abian, O., Esteller, M. and Velazquez-Campoy, A. (2017) The intervening domain from MeCP2 enhances the DNA affinity of the methyl binding domain and provides an independent DNA interaction site. Sci Rep.7, 41635.
3. Vega, S., Kang, L.W., Velazquez-Campoy, A., Kiso, Y., Amzel, L.M. and Freire, E. (2004) A structural and thermodynamic escape mechanism from a drug resistant mutation of the HIV-1 protease. Proteins.55, 594-602.
4. Velazquez-Campoy, A., Goñi, G., Peregrina, J.R. and Medina M. (2006) Exact analysis of heterotropic interactions in proteins: Characterization of cooperative ligand binding by isothermal titration calorimetry. Biophys J.91, 1887-1904.
5.Taneva, S.G., Bañuelos, S., Falces, J., Arregi, I., Muga, A., Konarev, P.V., Svergun, D.I., Velazquez-Campoy, A. and Urbaneja, M.A. (2009) A mechanism for histone chaperoning activity of nucleoplasmin: Thermodynamic and structural models. J Mol Biol.393, 448-463.
6. Felix, J., Weinhäupl, K., Chipot, C., Dehez, F., Hessel, A., Gauto, D.F., Morlot, C., Abian, O., Gutsche, I., Velazquez-Campoy, A., Schanda, P. and Fraga, H. (2019) Mechanism of the allosteric activation of the ClpP protease machinery bysubstrates and active-site inhibitors. Sci Adv.5, eaaw3818.
7. Abian, O., Neira, J.L. and Velazquez-Campoy, A. (2009) Thermodynamics of zinc binding tohepatitis C virus NS3 protease: a folding by binding event. Proteins.77, 624-636.

 

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Interview

Adrián Velázquez Campoy

Investigador ARAID, Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Universidad de Zaragoza

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P.- ¿Cuándo surgió su vocación científica?

R.- Mi vocación científica fue tardía. No tenía muy claro qué rumbo tomar cuando finalicé la licenciatura de Física en la Universidad de Granada al mismo tiempo que el grado profesional de Piano en el Conservatorio de esa misma ciudad. Podría decir que lancé una moneda, pero no es verdad; lamentablemente (o afortunadamente, según lo sucedido después) era tarde para una carrera musical profesional. Quizás, el hecho de que no estuviese ligado a la investigación hasta finalizar la licenciatura me hizo tratar de aprender rápidamente todo lo que pudiese de diferentes áreas durante mis etapas pre- y postdoctoral: programación, sistemas dinámicos,fenómenos interfaciales, estabilidad coloidal, calorimetría, equilibrio conformacional y de interacción, biología molecular, bioquímica, expresión y purificación de proteínas, enzimología... Aún recuerdo de mi etapa postdoctoral haber estado días y días leyendo el libro Proteins de Thomas Creighton, y, mucho más tiempo, el libro Binding and Linkage de Jeffries Wyman y Stanley Gill, intentando alcanzar el nivel de otros compañeros de laboratorio. Por tanto, quizás empecé tarde, pero con muchas ganas. No sé si alguien ha influido de forma especial ni recuerdo un consejo especial, pero sí puedo decir que de muchas personas, desde mis directores de tesis hasta compañeros laboratorio, colegas actuales e incluso estudiantes bajo mi tutela, he aprendido muchas cosas, tanto en el ámbito profesional como personal..

P.- ¿Podría resumirnos brevemente su trayectoria profesional?

R.- Mi carrera científica ha sido una secuencia afortunada de decisiones rápidas. Al terminar la licenciatura de Física en la especialidad de Física Teórica en la Universidad de Granada en 1992, no tenía muy claro qué hacer. Entre varias posibilidades, decidí realizar una tesis doctoral en el Departamento de Física Aplicada. En esa etapa aprendí mucho sobre programación, experimentación y análisis de datos con Miguel Cabrerizo Vílchez y Obdulio López Mayorga, y fruto de ese trabajo fue la construcción de un calorímetro isotérmico de valoración para estudiar procesos de adsorción de proteínas sobre partículas de látex funcionalizadas (lo que hoy llamamos nanopartículas en nanotecnología). Al finalizar el doctorado en 1998, Ernesto Freire, que formó parte de mi tribunal de tesis, me ofreció trabajar en su laboratorio del Departamento de Biología de la Universidad Johns Hopkins para estudiar la interacción de inhibidores clínicos y experimentales con la proteasa del virus VIH-1 mediante técnicas calorimétricas. Allí aprendí gran parte de lo que sé sobre estabilidad y plegamiento de proteínas, así como sobre interacciones proteína-ligando y proteína-proteína. Y sobre cómo esa información es valiosa para entender una interacción biomolecular, su papel en el mecanismo fisiológico natural o patológico, y su posible aplicación en el descubrimiento de fármacos. Después de 5 años, me reincorporé en 2003 al sistema de ciencia español como investigador del Programa Ramón y Cajal en el Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI) de la Universidad de Zaragoza. El cambio fue duro, pero tuve mucha suerte. En primer lugar,mi esposa, Sonia Vega, me ha acompañado profesionalmente desde mi etapa postdoctoral en USA. Y, en segundo lugar, el equipo directivo del BIFI me ofreció todas las facilidades posibles en mi trabajo y apoyó sin reservas la creación desde cero de un laboratorio experimental de Biofísica de Proteínas junto con Olga Abián, también investigadora del BIFI en ese momento. Mi objetivo particular era establecer un laboratorio de referencia nacional en Calorimetría de Proteínas, mi campo de especialidad. Ése fue el germen del actual laboratorio LACRIMA (Laboratorio Avanzado de CRibado e Interacciones Moleculares de Aragón), en cuya creación han contribuido, con esfuerzo personal y financiación pública competitiva, muchos compañeros del BIFI .Hoy día no sólo se realizan estudios biofísicos de proteínas, sino también estudios de biología molecular y celular en el marco de numerosos proyectos de investigación, casi todos centrados en estudiar cómo se comportan y funcionan las proteínas. Hoy puedo decir que el laboratorio LACRIMA dispone de una infraestructura experimental privilegiada que ha estado, y sigue estando, a disposición de usuarios internos y externos. Desde 2008 soy investigador de la Fundación ARAID adscrito al Instituto BIFI, donde continúo mi labor investigadora, lo que me permite disfrutar de estabilidad laboral y de facilidades a la hora de realizar mi trabajo.

P.- ¿Cuáles son, desde su punto de vista, las características que definen a un buen investigador? 

R.- No se puede establecer una categoría especial para el conjunto de los investigadores enumerando características que definen a un buen profesional, ya que muchas, o casi todas, de esas características son aplicables a otros profesionales. Un buen científico debe ser, en primer lugar, una buena persona. Esto puede parecer obvio o una tontería, pero creo que merece la pena recordar que esa debe ser la base sobre la que se construye una carrera profesional en la investigación. Además, un buen científico debe mostrar curiosidad, creatividad e interés por lo que le rodea, tener ganas de aprender y capacidad de trabajar de forma independiente y en equipo. Pero, también, debe estar dispuesto a aceptar que el fracaso puede ser más abundante que el éxito, y que sus posibilidades profesionales no sólo dependen de sí mismo. Por tanto, está claro que esas características son comunes a cualquier buen profesional de cualquier ámbito.

Hoy día la investigación y la ciencia están bien valoradas por la sociedad y los políticos que intentan dirigirla, pero no están bien apoyadas con recursos suficientes. No hay un convencimiento de que la ciencia es una actividad clave para el progreso y que es un motor de desarrollo. Existe un déficit de atención y de apoyo económico hacia la ciencia por parte del poder público, que se pone de manifiesto o se intenta solventar sólo cuando los investigadores protestan o en situaciones críticas como la actual (estoy escribiendo en plena pandemia COVID-19). Este déficit de atención y apoyo aparece desde mediados del siglo XIX. Anteriormente, desde el Renacimiento hasta la Ilustración, el poder público fue capaz de apreciar que el conocimiento y el saber derivados de la curiosidad pueden resultar en riqueza, no de forma inmediata como se exige ahora, sino a largo plazo.

P.- ¿Qué consejo daría a los que ahora inician su carrera científica? 

R.- Mi consejo para un investigador que esté empezando su carrera es que mantenga el entusiasmo, y tenga paciencia y tranquilidad para afrontar contratiempos y problemas (científicos, profesionales y personales), pero que tenga siempre esperanza sobre su resolución, de forma individual o en colaboración con otros.

P.- ¿Podría describirnos brevemente en qué consiste su línea de investigación actual y cuál es su trascendencia? 

R.- Mi trabajo está relacionado con el estudio del paisaje conformacional y la función de proteínas con relevancia biomédica. El paisaje conformacional es el conjunto de estados conformacionales que una proteína puede adoptar en condiciones fisiológicas o cercanas a éstas, y cuya población es modulada por interacciones con otras biomoléculas (iones, metabolitos, proteínas, etc.) o por mutaciones en su secuencia. De ese modo, la función de una proteína, así como sus interacciones en el organismo, dependen de qué estados conformacionales y funcionales predominan en dicho paisaje.

Mediante técnicas biofísicas, principalmente calorimetría, es posible caracterizar la energética de procesos bioquímicos que implican a proteínas. Aunque también es importante la caracterización cinética (velocidad de un proceso), es igualmente importante la caracterización termodinámica (e.g., cuánta energía requiere o proporciona una interacción o un cambio conformacional en una proteína, cual es el estado de equilibrio en un sistema, cuál es la estabilidad conformacional de una proteína o de un complejo).

Mediante técnicas biofísicas aplicadas a proteínas intentamos: 1) conocer el efecto de mutaciones asociadas con patologías; 2) establecer cómo son las interacciones con substratos naturales; 3) estudiar el acoplamiento entre cambios conformacionales e interacción y función (control alostérico); 4) describir las interacciones con efectores (inhibidores, activadores y cofactores) y los fenómenos cooperativos homo- y heterotrópicos asociados; 5) desarrollar modelos de interacción complejos para describir mecanismos fisiológicos de regulación; 6) diseñar y validar protocolos de cribado molecular experimental para identificar compuestos bioactivos capaces de modular (inhibir o rescatar) la función de una proteína diana; y 7) comprobar directamente la interacción de compuestos candidato con la proteína dianaas principales técnicas de calorimetría biológica, calorimetría isotérmica de titulación y calorimetría diferencial de barrido, disfrutaron de un auge durante los años 80-90, paralelo al florecimiento de la biología molecular y la expresión recombinante de proteínas, con la aparición de diferentes escuelas donde se desarrollaban las tecnologías y los protocolos experimentales de forma casi artesanal (Lund en Suecia; Colorado, Yale, Virginia y Brigham-Young en USA; Moscú en URSS). Después de una etapa de cierto estancamiento acompañada por su consolidación y amplia disponibilidad gracias a equipos comerciales de alta sensibilidad y automatización, se han convertido en el gold-standard para estudiar interacciones y estabilidad estructural en proteínas gracias a su versatilidad para afrontar desde los sistemas más simples a los más complejos.

P.- ¿Cuál consideraría que ha sido el principal avance científico del siglo XX? ¿Cuál es el que más le ha impresionado? ¿Cuál ha sido su mayor sorpresa en el área de investigación en que trabaja? 

R.- Como una de las principales armas del sistema sanitario, la vacunación, se empezó a desarrollar mucho antes del siglo XX, destacaría la otra arma, los antibióticos. Ambos forman parte esencial del arsenal médico existente para combatir a microorganismos patógenos, abarcando desde la prevención hasta el tratamiento terapéutico.

Me ha impresionado el hecho de que, a partir del estudio en profundidad de la Epigenética, actualmente podemos emplear herramientas que actúan a nivel epigenético para modular procesos fisiológicos o patológicos. La Epigenética es una rama muy joven, pero explica procesos tan básicos como la diferenciación de una célula progenitora en un cardiomiocito o en una neurona.

Una sorpresa para mí ha sido descubrir la gran versatilidad de la estructura de las proteínas, de su susceptibilidad a su entorno y su capacidad de acoplar interacciones con cambios conformacionales, y de la gran variedad de mecanismos de regulación en sistemas biológicos dependientes de proteínas. Y, relacionado con todo esto, cómo es posible modelar cuantitativamente esos procesos a partir de datos experimentales relativamente sencillos, en consonancia con la regla de Galileo: misuraciò che è misurabile, e rendi misurabile ciò che non lo è.

 

Biography

Adrián Velázquez Campoy

Investigador ARAID, Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Universidad de Zaragoza

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Adrián Velázquez Campoy realizó su tesis doctoral en el Departamento de Física Aplicada de la Universidad de Granada, estudiando la adsorción de proteínas sobre nanopartículas. Durante su estancia postdoctoral en el laboratorio de Ernesto Freire (Departamento de Biología, The Johns Hopkins University, 1998-2003) trabajó en el estudio de la interacción de inhibidores clínicos y experimentales con la proteasa del VIH-1, participando en el desarrollo de un nuevo paradigma de diseño de fármacos para proteínas diana variables, y en la identificación de inhibidores de la proteasa 3CLpro del virus SARS. En 2003 se reincorporó como investigador Ramón y Cajal en el Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI) de la Universidad de Zaragoza. Actualmente trabaja como investigador ARAID en el estudio biofísico de proteínas diana para su aplicación en descubrimiento de fármacos. En 2018 fue nombrado Académico Correspondiente de la Real Academia de Medicina de España.

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