La Crio-Microscopía Electrónica para el estudio de virus y aplicaciones biotecnológicas

Artículo publicado en junio de 2020

DOI: htttp://dx.doi.org/10.18567/sebbmdiv_ANC.2020.06.1

José R. Castón

Centro Nacional de Biotecnología - CSIC, Madrid

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Los virus son ensamblados macromoleculares dinámicos y metaestables que representan un paradigma de optimización de recursos. Una o unas pocas proteínas se autoensamblan en un nanocontenedor multifuncional, la cápsida. La crio-microscopía electrónica permite el análisis estructural de los virus a resolución cuasi-atómica, un paso necesario para desarrollar nuevas terapias y utilizarlos como plataformas en aplicaciones biotecnológicas.

Las unidades funcionales de la vida son complejas asociaciones de macromoléculas altamente ordenadas que controlan todos los procesos fundamentales en la célula. Estas máquinas moleculares son ensamblados dinámicos de proteínas (algunos contienen ácidos nucleicos) que convierten la energía química en cambios conformacionales. La comprensión de estos procesos requiere establecer la organización estructural de sus componentes individuales; muchos de estos procesos celulares se han descubierto directa o indirectamente a través del estudio de virus. Aunque las cápsidas virales están implicadas en múltiples funciones durante el ciclo viral, muchas contienen solo unas pocas proteínas que, a partir de su polimorfismo estructural, se autoensamblan para formar un contenedor proteico con simetría icosaédrica o helicoidal.

Los nanocontenedores proteicos como las cápsidas virales están muy extendidos en la naturaleza, desde la encapsulina y la chaperona GroEL/ES en bacterias, hasta los vaults y ferritinas en eucariotas. Estas “nanocajas” proteicas están siendo analizadas para aplicaciones en nanotecnología, nanomedicina y ciencias de los materiales, ya que pueden modificarse química y/o genéticamente, y su cavidad puede almacenar distintos cargos moleculares. Estos nanocontenedores son excelentes plataformas como nanoreactores, vehículos de transporte de fármacos y presentación de antígenos, en medicina de imagen, o como orgánulos artificiales. Las pseudo-partículas virales (VLPs), o cápsidas no-infecciosas derivadas de virus que carecen del genoma viral, constituyen una plataforma óptima para el desarrollo de nuevos sistemas biomiméticos. Para ello, el análisis de la estructura atómica de las VLPs, sus propiedades mecánicas, así como el ensamblaje de las proteínas estructurales son necesarios, no sólo para comprender los procesos naturales en los que están implicadas, sino también para determinar cómo pueden ser rediseñadas para desarrollar nuevas funcionalidades.

La crio-microscopía electrónica tridimensional (crio-ME 3D) y la microscopía de fuerzas atómicas (AFM) de virus y cápsidas virales son complementarias para analizar la estrecha relación estructura-función. Mientras que la crio-ME 3D permite la visualización directa de ensamblados macromoleculares en su conformación nativa y en su contexto celular, mediante AFM se determinan propiedades mecánicas como la flexibilidad, la fragilidad y la respuesta a interacciones con otros factores externos. Recientemente, la crio-ME ha revolucionado la biología estructural, y es posible determinar a resolución atómica la estructura de numerosos ensamblados macromoleculares a partir de varios miles de imágenes bidimensionales adquiridas con un detector directo de electrones. Además de posibilitar el análisis dinámico de los ensamblados virales, la crio-ME tridimensional se ha constituido en una herramienta óptima para el desarrollo de ensamblados virales más eficientes, y la virotecnología estructural es una realidad.

Desde hace más de 15 años, mi laboratorio de Máquinas Moleculares Virales en el Centro Nacional de Biotecnología/CSIC ha caracterizado el polimorfismo estructural y temporal de numerosas cápsidas virales y otros complejos virales como las RNA-polimerasas (sin simetría interna), el genoma viral empaquetado, y estructuras filamentosas con simetría helicoidal [http://www.cnb.csic.es/~jrcaston/Caston-lab/Home.html]. La cápsida viral está implicada en múltiples funciones: se ensambla en un compartimento cerrado, selecciona el ácido nucleico viral en el entorno celular, protege el genoma viral durante su transporte de un hospedador a otro, reconoce su receptor específico, se internaliza en la célula huésped y, finalmente, libera el ácido nucleico para su replicación. Algunas cápsidas incluso participan activamente en la replicación del genoma. Por tanto, la visión de las cápsidas como estructuras cerradas e inertes es inadecuada y deben ser consideradas estructuras dinámicas y metaestables. Mi grupo está trabajando con distintos sistemas virales de diversa complejidad. Nuestros estudios en el virus de la bursitis infecciosa (IBDV), un virus RNA de cadena doble (dsRNA), abarcan todos los procesos clave de su ciclo viral. El ensamblaje de IBDV, similar al de los bacteriófagos dsDNA, se inicia con una procápsida basada en una proteína de andamiaje transitoria. Sin embargo, la proteína de la cápsida es similar a la de los picornavirus (virus RNA de cadena sencilla de polaridad positiva que incluyen muchos patógenos humanos), y su genoma está organizado como complejos ribonucleoproteicos, típicos de virus ssRNA de polaridad negativa. Es decir, desde un punto de vista evolutivo, IBDV comprende características de los diversos linajes virales actuales. Los análisis estructurales a resolución cuasi-atómica se han extendido a otros sistemas más simples como los virus dsRNA de hongos, en particular el chrysovirus de Penicillium chrysogenum (PcV) y el quadrivirus de Rosellinia necatrix (RnQV1), y los virus ssRNA del resfriado humano (rhinovirus humano tipo 2, HRV2) y de la fiebre hemorrágica del conejo (RHDV).

El amplio conocimiento sobre la estructura y función de numerosas proteínas y cápsidas virales nos ha permitido plantearnos introducir modificaciones en sus estructuras para desarrollar nuevos nanocontenedores y nanotransportadores. En este sentido hemos construido VLPs quiméricas de IBDV que contienen epítopos de distintas proteínas del virus de la gripe humana. También hemos analizado VLPs hídridas del virus del moteado clorótico del guisante (CCMV) conteniendo cromóforos con interés médico como las ftalocianinas, o como nanocontenedor para reacciones en cascada catalizadas por varias enzimas, y del bacteriófago P22 con distintas proteínas heterólogas. Otras cápsidas que estamos analizando para el desarrollo de futuras aplicaciones biotecnológicas son las del picobirnavirus humano y la encapsulina bacteriana. Es decir, las aplicaciones biotecnológicas basadas en el conocimiento de la estructura de los virus están en pleno desarrollo en nuestro grupo.

 

 

 SEBBM fig caston

 Figura. Diversas aplicaciones biotecnológicas de los virus como nanocontenedores proteicos

 

Referencias:

1. R. Castón and J.L. Carrascosa (2013). The basic architecture of viruses. Subcell. Biochem. 68, 53-75.
2. D. Luque, J. Gómez-Blanco, D. Garriga, A.F: Brilot, J.M. González, W.M. Havens, J.L. Carrascosa, B.L. Trus, N. Verdaguer, S.A. Ghabrial and J.R. Castón (2014). Cryo-EM near-atomic structure of a dsRNA fungal virus shows ancient structural motifs preserved in the dsRNA viral lineage. Proc Natl Acad Sci U S A 111, 7641-7646.
3. R.M. Putri, C. Allende-Ballestero, D. Luque, R. Klem, K.-A. Rousou, A. Liu, C. H.-H. Traulsen, W.F. Rurup, M.S.T. Koay, J.R. Castón and J.J.L.M. Cornelissen (2017). Structural characterization of native and modified encapsulins as nanoplatforms for in vitro catalysis and cellular uptake. ACS Nano 11, 12796-12804.
4. C.P. Mata, D. Luque, J. Gómez-Blanco, J.M. Rodríguez, J.M. González, N. Suzuki, S.A. Ghabrial, J.L. Carrascosa, B.L. Trus and J.R. Castón (2017). Acquisition of functions on the outer capsid surface during evolution of double-stranded RNA fungal viruses. PLoS Pathog 13, e1006755 (2017).
5. C.P. Mata, J. Mertens, J. Fontana, D. Luque, C. Allende-Ballestero, D. Reguera, B.L. Trus, A.C. Steven, J.L. Carrascosa, and J.R. Castón (2018).The RNA-binding protein of a double-stranded RNA virus acts like a scaffold protein. J. Virol. 92, e00968-18
6. M.V. de Ruiter, R. Klem, D. Luque, J.J.L.M. Cornelissen and J.R. Castón (2019). Structural nanotechnology: three-dimensional cryo-EM and its use in the development of nanoplatforms for in vitro catalysis. Nanoscale 11, 4130-4146.
7. D. Luque and J. R. Castón (2020). Cryo-electron microscopy for the study of virus assembly. Nat Chem Biol 16, 231-239.

 

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Entrevista

José R. Castón

Centro Nacional de Biotecnología - CSIC

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P.- ¿Cuándo surgió su vocación científica? ¿Le influyó alguien de forma especial? ¿Recibió de joven algún consejo al cual siga siendo fiel?

R.- Creo que mi vocación por las ciencias de la vida empezó a surgir en mi último año de instituto antes de ir a la universidad. Siempre me gustaron más las asignaturas de ciencias que las de letras, posiblemente por los profesores que tuve, y la Biología en particular, que explica la vida, me pareció fascinante. En principio pensé estudiar Medicina, con la idea de curar enfermedades, pero no saqué la nota suficiente e hice Biología. No me importa reconocerlo porque nunca después me pesó; uno podría pensar que nace para una carrera determinada pero, después de la experiencia acumulada, creo que uno se hace para lo que realmente le gusta. Aunque en el primer año se estudiaban las asignaturas básicas de ciencias, al acabar el curso decidí seguir en Biología. Como he dicho antes, pienso que el científico se va haciendo poco a poco. Durante 3º de carrera contacté con el profesor David Vázquez, del Centro de Biología Molecular y, después de una entrevista personal, me aceptó para realizar prácticas en su laboratorio de Envolturas Celulares durante los meses de verano mientras que acababa 4º y 5º. Fue la primera persona que me dio la oportunidad de trabajar en un laboratorio, en la frontera entre lo establecido y lo que se está estableciendo. Entonces ya tenía decidido continuar en el mundo de la investigación, contaba con el apoyo del profesor Vázquez, y tomé una decisión que aún hoy me sorprende un poco, pero de la que no me arrepiento por lo que vino después. Cuando acabé 3º interrumpí mis estudios para hacer la mili (en aquellos tiempos no existía aún el servicio sustitutorio y la objeción de conciencia acarreaba penas de prisión), porque cuando acabase mis estudios, no quería tener interrupciones en lo que ya tenía decidido, mi carrera investigadora. Lamentablemente, el profesor Vázquez falleció en febrero de 1986.Cuando me reincorporé a mis estudios, durante 5º de carrera conseguí mi primera beca de investigación del INAPE (Instituto Nacional de Asistencia y Promoción al Estudiante), y así estuve, entre becas y contratos, hasta que conseguí una plaza de científico titular del CSIC en el 2005.

P.- ¿Podría resumirnos brevemente su trayectoria profesional? ¿La repetiría en su totalidad?

R.- Cuando acabé mis estudios de Biología en la especialidad de Bioquímica y Biología Molecular conseguí una beca de 3er ciclo de la UAM para realizar mi tesina, en el laboratorio de Envolturas celulares del Centro de Biología Molecular (CSIC-UAM) bajo la dirección de José Berenguer Carlos. Después conseguí una beca predoctoral FPI del CSIC para realizar mi tesis doctoral, a caballo entre el citado laboratorio y el laboratorio de Microscopía Electrónica de José L. Carrascosa. Mis estudios se centraron en el análisis bioquímico y estructural de la proteína de membrana de la capa S de la bacteria Thermus thermophilus mediante microscopía electrónica convencional.

El periodo postdoctoral, dos años como becario del Ministerio de Educación y Ciencia, y otros dos con una beca Fogarty, lo realicé en el laboratorio de Alasdair Steven de los National Institutes of Health (NIH, Bethesda, EEUU). Estuve implicado en el análisis estructural del virus L-A de Saccharomyces cerevisiae mediante microscopía electrónica de transmisión y barrido (STEM), en colaboración con Joseph Wall (Brookhaven National Laboratory, Upton, EEUU), y en el análisis por criomicroscopía electrónica (crio-ME) y reconstrucción tridimensional del virus L-A aplicando simetría icosaédrica, en colaboración con Reed Wickner (NIH). Estos 4 años, y no sólo en el aspecto científico, fueron de los mejores años de mi vida, y fue cuando realmente aprendí a enfocar un problema científico, estando pendiente de todos los detalles y circunstancias que rodea a un experimento, “solo ante el peligro” (excepto la financiación, claro). Me especialicé en los métodos de crio-ME, que permiten la visualización directa de las macromoléculas en condiciones nativas, preservando la integridad estructural a resolución atómica.

Cuando volví al sistema de investigación español, con un contrato de reincorporación del Ministerio de Educación y Ciencia con Pepe Carrascosa en el Centro Nacional de Biotecnología (CSIC), implementé la metodología de la crio-ME, así como la reconstrucción tridimensional de virus icosaédricos; fuimos pioneros en España en publicar la estructura de un virus a partir de imágenes de crio-ME. Después de otros contratos y becas, en diciembre de 2001 conseguí un contrato de 5 años en la 1ª convocatoria del programa Ramón y Cajal, lo que me daba cierta estabilidad por primera vez después de tantos años.

Mi grupo de investigación quedó constituido formalmente en enero de 2003. Los sistemas modelo que he estado estudiando para establecer las bases moleculares de la flexibilidad conformacional de las proteínas y sus implicaciones funcionales han sido diversas cápsidas de virus de interés clínico y/o veterinario, y otros ensamblados macromoleculares esenciales de los virus. Nuestros estudios nos han permitido la implantación de métodos de análisis de alta resolución y, más recientemente, la determinación de la estructura atómica de las proteínas directamente a partir de imágenes bidimensionales de crio-ME. Este nivel de detalle nos permite manipular los virus e interpretar sus características con gran precisión. A pesar de la consolidación de la crio-ME, elegida como método del año 2015 en la revista Nature, me sigue pareciendo asombroso el nivel de detalle conseguido (en algunos casos 2 Å de resolución) cuando hasta hace poco era considerada como un método de la “blobología”. Los análisis estructurales de virus los estamos complementando con el estudio de sus propiedades mecánicas mediante microscopía de fuerzas atómicas. En conjunto, estos análisis han resultado en el establecimiento de las bases para construir y diseñar cápsidas biohíbridas para su uso en aplicaciones biotecnológicas.

Me siento particularmente orgulloso de las numerosas colaboraciones y amistades que han surgido a lo largo de estos años con numerosos grupos nacionales e internacionales del CSIC, Instituto de Salud Carlos III, Ingenasa, CISA-INIA, de las Universidades Autónoma y Complutense de Madrid, y de la Universidad de Barcelona, Max Perutz Laboratory (Austria), Universidad de Okayana (Japón), Universidad de Twente (Holanda) y las universidades de Brandeis, Kentucky, Virginia e Indiana y NIH (EE UU).

P.- ¿Cuáles son, desde su punto de vista, las características que definen a un buen investigador¿ ¿Qué consejo daría a los que ahora inician su carerra científica? 

R.- La vocación y la curiosidad científica quizá sean las características iniciales más importantes. Un investigador debe amar su profesión en el sentido más literal de la palabra porque nos estamos enfrentando a numerosas adversidades constantemente; cuántas veces tenemos que repetir un experimento porque se te olvidan controles, te “falla” una de las muestras o, simplemente, porque crees que puede salir con más nitidez; cuántas veces envías un manuscrito a publicar y te lo rechazan y lo tienes que volver a reescribir o incluso a reestructurar con nuevos experimentos; cuántas veces pedimos financiación para nuestros proyectos y nos conceden menos de lo que solicitábamos. Y así muchas más cosas. Como suelo decir, hay que tener las espaldas muy anchas. Para afrontar estas dificultades son necesarias cualidades como la honestidad profesional, ser crítico consigo mismo, humildad (el investigador debe estar al servicio de la ciencia y no al revés), perseverancia y, por qué no, un poco de suerte y clarividencia para decidir el camino a seguir, ese ego del que tanta fama tienen (o tenemos) algunos investigadores. A todo esto, le añadiría que el investigador debe estar constantemente renovándose y actualizándose para “no morir” en el camino. Debemos, en cierta manera, seguir estudiando durante toda nuestra carrera, pendientes de las novedades de nuestro campo de investigación, porque la ciencia se hace sobre la ciencia.

Mi consejo a los que inician su carrera científica es que lo den todo en este mundo de la ciencia. Ya sé que hay vida fuera del laboratorio, como les digo a mis becarios, que yo también la tengo. Nuestra carrera es, en general, una carrera de fondo, en la que el desánimo solo te puede durar unas horas o unos días, pero hay que levantarse rápidamente. Y aunque lamentablemente conozco alguna excepción a pesar de este enorme esfuerzo, en general nos vamos haciendo nuestro hueco y llega el reconocimiento a nuestro trabajo. Esto ocurre en muchos otros ámbitos de nuestra sociedad, no sólo en el aspecto científico. De un tiempo a esta parte observo que existe cierta desgana en realizar un postdoc fuera de España y, sin embargo, es una etapa muy enriquecedora a nivel profesional y personal. Mi posdoc en EEUU lo considero imprecindible en mi vida científica y lo volvería a repetir sin dudarlo.

P.- ¿Podría describirnos brevemente en qué consiste su línea de investigación actual y cuál es su trascendencia? ¿Cómo ve el futuro de esta área científica? 

R.- Nuestro grupo se constituyó como un grupo de investigación básica en virología estructural. Para ello hemos utilizado la crio-ME tridimensional como herramienta básica para, a partir de la estructura de las proteínas, desentramar sus propiedades y mecanismos de acción. Es decir, establecer las relaciones estructura-función en los ensamblados virales. Nos hemos centrado en el polimorfismo estructural de las proteínas de la cápsida, un aspecto básico en la construcción de los virus que permite a una proteína adquirir distintas conformaciones. Este problema no es nada trivial y está finamente regulado por factores intrínsecos en la secuencia y/o estructura de la proteína de la cápsida, y por factores externos mediados por otras proteínas y/o ácidos nucleicos, pero no es exclusivo de los virus; el polimorfismo estructural (y temporal) está extendido en muchos procesos fundamentales de la biología. Desde que tenemos la posibilidad de calcular estructuras de complejos macromoleculares a resolución atómica, también hemos podido establecer relaciones evolutivas entre virus de muy diversas familas. Nuestro conocimiento estructural de los virus lo hemos complementado con estudios biofísicos para estudiar características como la fragilidad o la fatiga mecánica, que no son evidentes desde la propia estructura. Finalmente, toda esta ciencia básica la estamos trasladando hacia aplicaciones biotecnológicas, modificando el papel original de las cápsidas de protección del genoma viral hacia nanocontenedores de compuestos químicos o enzimas con interés en medicina o en ciencia de materiales, o como vehículos de transporte y presentación de antígenos. Esta área, que oficiosamente denomino virotecnología estructural, está en sus inicios a pesar de los numerosos estudios ya publicados, y sin duda tendrá un gran impacto social en los próximos años.

P.- ¿Cuál es su opinión sobre cómo está articulada la carrera científica en España? ¿Qué camino queda por recorrer en Ciencia e Innovación en nuestro país? 

R.- Creo que en nuestro país hay una base excelente de científicos, como en muchos otros países con una gran tradición científica, pero que, a pesar de las muchas mejores que han ocurrido en los últimos años durante la democracia, ningún gobierno apuesta decididamente a consolidar la ciencia de manera integral en nuestra sociedad. Creo que tenemos la sensación que el ritmo de inversiones siempre está por debajo de nuestras expectativas, y que cuando hay una crisis económica, somos los primeros en ser sacrificados, a pesar de lo que representan estas inversiones en el gasto general del Estado. Ahora, con la crisis del coronavirus SARS-CoV-2, se hace más evidente que nunca lo importante que es la investigación básica. Los coronavirus llevan ahí muchos años, quizá fueron “ninguneados” mucho tiempo porque no causaban enfermedades importantes en humanos. Pero para desarrollar programas de investigación aplicada que incluyan vacunas y antivirales es fundamental tener un conocimiento básico de su ciclo viral. Es una lección que la sociedad tiene asumida, porque no es la primera pandemia (ni la última) a la que nos enfrentaremos. Cuando acabe todo esto, me gustaría pensar que nos vamos a replantear acciones integrales de prevención en la sanidad y en la ciencia, y que no volveremos a los vicios antiguos; ojalá que no me equivoque. Cuando dejemos de hablar que la investigación en España se consolide en un 2% del PIB o superior, habremos dado un gran paso. Estas deficiencias en inversiones en investigación están mucho más extendidas en el ámbito de las empresas privadas en nuestro país.

La carrera cientifica en España es excesivamente selectiva; está destinada, en general, para estudiantes “super-excelentes”, lo cual está muy bien, pero se deben extender las oportunidades a los que también son “sólo muy buenos”. Incluso muchos de estos “super-excelentes” estudiantes no pueden seguir su carrrera científica por falta de financiación en etapas posteriores. Y algo que echo en falta es que la carrera científica en España está pensada para producir nuevos investigadores, nuevos jefes de líneas de investigación, pero también hacen falta investigadores científicos de apoyo, técnicos superiores e intermedios y otro personal de apoyo técnico. La investigación en España está sustentada mayoritariamente en investigadores jefes y becarios, sin duda ambos con una implicación desinteresada por la ciencia, pero echo en falta una escala intermedia consolidada. Aun así, en las condiciones actuales creo que nuestra productividad científica es excelente.

 

Perfil biográfico

José R.Castón

Centro Nacional de Biotecnología - CSIC, Madrid

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José R. Castón es el investigador principal del Laboratorio de Máquinas Moleculares Virales en el Centro Nacional de Biotecnología del CSIC en Madrid. Se graduó en Biología por la Universidad Autónoma de Madrid (UAM) en 1988, y realizó su tesis doctoral en el Centro de Biología Molecular (CSIC-UAM), bajo la dirección de José Berenguer Carlos y José L. Carrascosa, estudiando la proteína de la capa S de Thermus thermophilus mediante microscopía electrónica convencional (1988-1992). En el periodo postdoctoral (1993-1997) en el laboratorio de Alasdair C. Steven (NIH, Bethesda, EEUU) realizó el análisis estructural del virus L-A de levadura. En esta etapa se especializó en la crio-microscopía electrónica tridimensional que permite determinar la estructura 3D en condiciones nativas. Cuando se incorporó al sistema de investigación español, inicialmente con el Dr. Carrascosa (CNB-CSIC), implementó la metodología de la crio-ME, así como la reconstrucción tridimensional de virus icosaédricos. Como investigador Ramón y Cajal (2001-2006) constituyó su propio grupo de investigación, y en el año 2006 obtuvo una plaza de científico titular del CSIC, que consolidó como investigador científico del CSIC en 2010. Sus investigaciones se centran en el análisis estructural, funcional y evolutivo de virus de diversa complejidad, implementando la determinación directa de la estructura atómica de las proteínas a partir de imágenes de crio-ME. El análisis estructural es complementado con el estudio de las propiedades mecánicas mediante microscopía de fuerzas atómicas. Estos estudios combinados han desembocado en la actualidad en el área de la virotecnología estructural.

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